紫花前胡苷抗宮頸癌細胞作用研究

付瓊，殷金鳳，顏愛華

宮頸癌是女性最常見的婦科惡性腫瘤之一，其發生率僅次于乳腺癌。有研究統計顯示，2018年全球宮頸癌新發病例累計569 847例，死亡病例累計311 365例，發病率在女性腫瘤中的占比高達6.6%?；谌蚣膊∝摀鷶祿难芯堪l現，宮頸癌在不同地區或國家中的發病率存在差異，發展中國家的宮頸癌患者死亡率是發達國家的18倍左右，占所有宮頸癌相關死亡人數的85%，嚴重危害女性健康。宮頸癌的發生同人乳頭瘤病毒（hu‐man papilloma virus，HPV）的感染明顯相關，近些年隨著醫療水平的進步、HPV疫苗的普及以及篩查的普及，宮頸癌的發生及死亡率有所下降，但是在發展中國家仍是威脅女性健康的隱形殺手。宮頸癌的發病機制至今尚未完全明確，多致病因素、多基因調控共同參與了其發生發展。宮頸細胞增殖凋亡及侵襲轉移能力的變化，宮頸組織中原癌基因的過度激活以及抑癌基因的異常表達是癌癥進展的基本病理特征。

目前宮頸癌的治療手段以手術結合放化療治療為主，癌組織的切除縮減能在一定程度上改善患者的臨床癥狀、延長其生存時間，但是這些治療手段無疑都會對機體帶來創傷，且化療耐藥也是制約宮頸癌治療效果的關鍵因素之一，因此尋找更為安全有效的治療方式或治療藥物是保護女性健康，減輕社會負擔的重要手段。近年來，中醫藥研究發現相關單體藥物不僅能直接抑制宮頸癌細胞的生長，還會在一定范圍內調節化療耐藥，具有其重要調節優勢。紫花前胡苷是中藥紫花前胡的有效成分，是一種線型四氫呋喃型香豆素苷類化合物，具有抗炎、抗過敏、抗氧化及免疫調節作用，在多種疾病中發揮治療功效，但其對宮頸癌的治療作用尚未有相關報道。本研究以宮頸癌HeLa細胞為研究對象，在不同濃度的紫花前胡苷作用后，對其凋亡、自噬等相關特性進行檢測，初步探究紫花前胡苷對宮頸癌細胞的作用及其相關信號通路。

1 材料與方法

圖1 紫花前胡苷分子結構圖

1.1 材料及試劑

人宮頸癌永生化HeLa細胞株購自American Type Culture Collection（Manassas，VA，USA）。HeLa細胞于含10%胎牛血清（Hyclone，澳大利亞）及1%青鏈霉素抗體（基諾生物科技有限公司）的DMEM高糖培養基（Hyclone，澳大利亞）中培養。紫花前胡苷及對照品購自天津士蘭科技有限公司（分子結構如圖1），凋亡試劑盒購自BD公司，LC3B腺病毒（Ad-GFP-LC3B）購自碧云天生物科技有限公司。抗體來源及配比如下：cle-caspase3（1∶1 000，absin，abs132005），Cyto C（1∶1 000，proteintech，10993-1-AP），Bax（1∶5 000，proteintech，50599-2-Ig），Bcl2（1∶2 000，proteintech，12789-1-AP），pmTOR（1∶2 000，abcam，ab109268），m-TOR（1∶2 000，abcam，ab2732），P62（1∶3 000，proteintech，18420-1-AP），Beclin1（1∶2 000，proteintech，11306-1-AP），GAPDH（1∶10 000，proteintech，60004-1-Ig）。

1.2 CCK-8法細胞增殖活性檢測

取對數期生長細胞以5 000個/孔接種于96孔板，培養24 h后更換為含不同濃度的紫花前胡苷的培養基繼續培養24 h，小心棄去培養基，每孔中加入配好的CCK-8溶液100μL，3副孔/組，并設置CCK-8檢測試劑空白對照組。37℃恒溫培養箱孵育1～4 h后在450 nm吸收波長處進行OD值測量，以對照組OD值為1左右時的數值計算細胞增殖活性，計算公式為：處理組細胞增殖活力（%）=［（處理組OD值－無細胞對照孔OD值）/（對照組OD值－無細胞對照孔OD值）］×100%，每組結果由3組獨立的重復試驗組成。

1.3 凋亡檢測

將處理好的對照組及處理組細胞輕輕用PBS沖洗3次后，純胰酶消化3～5 min，完全培養基終止后輕輕吹打轉移至離心管內，800 r/min×7 min離心消化。PBS洗滌兩次后加入100μL的1×Annexin結合液，充分吹打混勻細胞后，每管分別加入5μL的Annexin-PE及AAD染液，常溫下避光孵育15 min后，上流式細胞儀進行檢測。每組結果由3組獨立的重復試驗組成。

1.4 蛋白質印跡法

胰蛋白酶消化細胞收集后通過RIPA裂解液（含cocktail）裂解細胞后冰浴30 min。低溫超速離心后（4℃下12 000 r/min×10 min）提取蛋白質上清，BCA法進行蛋白濃度定量分析。蛋白樣品加入5×蛋白上樣緩沖液后95℃金屬浴5 min，分裝后-20℃保存樣品。每次SDS-PAGE膠電泳取蛋白30微升/孔，經10%～15%凝膠分離后，將蛋白轉印至PVDF膜上，BSA封閉后加入相應一抗孵育過夜。第2天，TBST洗膜5 min×3次，生物素標記的二抗常溫下孵育1 h后，BeyoECL化學發光試劑進行顯色。結果采用Image Lab分析目的蛋白相對表達量。每組結果由3組獨立的重復試驗組成。

1.5 細胞腺病毒轉染

細胞消化混懸后進行鋪板，使得12 h后的細胞密度達20%～30%。腺病毒Ad-GFP-LC3B轉染MOI值選擇為50。轉染24 h后觀察轉染效果并進行換液，72 h后進行藥物干預24 h。4%多聚甲醛固定液固定、封片于共聚焦顯微鏡下進行觀察、拍照。每組實驗獨立重復3次。

2 結果

2.1 紫花前胡苷可抑制HeLa細胞增殖活性并促進凋亡

HeLa細胞在0、0.1、1、10 mmol/L濃度的紫花前胡苷作用24 h后的細胞增殖活性檢測（CCK-8法）四組細胞處理后OD450分別為1.07±0.14、0.91±0.06、0.74±0.17、0.35±0.13。與對照組（0 mmol/L）細胞相比，0.1 mmol/L濃度處理24 h后細胞增殖活性降低，但差異無統計學意義（P=0.383），而1 mmol/L、10 mmol/L濃度處理24 h后細胞增殖活性明顯降低，差異有統計學意義（P=0.038，P＜0.001）；此外，分別與0.1 mmol/L、1 mmol/L組相比，10 mmol/L濃度處理組細胞增殖活性明顯降低，差異有統計學意義（P=0.003，P=0.027）。處理后HeLa細胞的凋亡水平如圖2所示：對照組（0 mmol/L）、0.1 mmol/L組、1 mmol/L組、10 mmol/L組的HeLa細胞凋亡率依次升高，分別 為（14.93±2.95）%、（15.43±2.13）%、（21.63±3.19）%、（31.42±5.01）%，且在10 mmol/L濃度處理下升高最為明顯，差異有統計學意義（P=0.001）；此外，分別與0.1 mmol/L、1 mmol/L組相比，10 mmol/L濃度處理組細胞凋亡水平明顯升高，差異有統計學意義（P=0.002、P=0.036）。上述結果表明，紫花前胡苷可抑制HeLa細胞增殖活性并促進凋亡，并呈一定的劑量依賴效應關系，10 mmol/L的紫花前胡苷處理24 h組細胞的活力明顯下降、凋亡率明顯升高，后續實驗處理組選用條件為10 mmol/L紫花前胡苷處理24 h。

2.2 紫花前胡苷可激活HeLa細胞內的凋亡信號通路

10 mmol/L的紫花前胡苷處理24 h后，收集細胞進行蛋白免疫印跡實驗，檢測紫花前胡苷處理前后HeLa細胞細胞內凋亡信號通路相關cle-caspase3、Cyto C、Bax、Bcl2的蛋白水平變化。結果如圖3所示，與對照組相比，紫花前胡苷處理后細胞內凋亡相關蛋白cle-caspase3［（0.99±0.23）比（2.21±0.23），P=0.010］、Cyto C［（0.93±0.23）比（2.60±0.32），P=0.032］、Bax［（1.05±0.17）比（0.34±0.08），P＜0.001］水平升高，抗凋亡蛋白Bcl2表達下降［（0.93±0.17）比（0.34±0.08），P=0.038］，均差異有統計學意義。表明紫花前胡苷處理后細胞內的線粒體相關的凋亡信號通路被激活。

圖2 不同濃度的紫花前胡苷作用24 h后，CCK-8檢測不同組之間HeLa細胞活力

圖3 紫花前胡苷處理后HeLa細胞內的凋亡信號通路檢測

2.3 紫花前胡苷處理后HeLa細胞內自噬信號相關蛋白上調

10 mmol/L的紫花前胡苷處理24 h后，收集細胞進行蛋白免疫印跡實驗，檢測紫花前胡苷處理后HeLa細胞細胞內p-mTOR、mTOR、P62、Be‐clin1、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ的蛋白水平變化。結果如圖4所示，與對照組相比，紫花前胡苷處理后細胞內pmTOR/mTOR比 例 下 降［（1.01±0.23）比（0.30±0.11），P=0.031］，Beclin1表達及LC3-II/LC3-I升高［（1.02±0.10）比（2.21±0.19），P=0.016；（1.05±0.25）比（3.62±0.70），P=0.043］，自噬流發生相關蛋白P62表達下降（0.94±0.13 vs.0.39±0.03，P=0.027），均差異有統計學意義。因此，紫花前胡苷處理后HeLa細胞內自噬信號相關蛋白上調，表明紫花前胡苷可能激活HeLa細胞內的自噬相關信號通路。

2.4 紫花前胡苷促進HeLa細胞內LC3B的顆?；奂?

Ad-GFP-LC3B轉染72 h后轉染效率高達90%以上。10 mmol/L的紫花前胡苷處理24 h后，共聚焦顯微鏡下觀察LC3B分布狀態。紫花前胡苷處理后細胞內的LC3B成顆粒性聚集，說明了自噬小體的生成增多。對照組與處理組每個細胞內自噬小體生成顆粒分別為（2.67±3.06）、（78.0±11.1），差異有統計學意義（P＜0.001）。進一步證實紫花前胡苷處理可上調HeLa細胞內的自噬相關信號通路。

3 討論

圖4 紫花前胡苷處理后HeLa細胞內的自噬相關信號通路檢測

宮頸癌的發生是正常宮頸上皮在多種理化因素刺激下逐漸發生瘤樣病變的過程，持續的致癌因素刺激最終導致了浸潤性宮頸癌的發生。中晚期進展性宮頸癌患病后死亡率較高，對于早期的宮頸癌而言，及時的治療干預可明顯改善患者預后。癌細胞的過度增殖、抗凋亡特性的增強以及自噬信號的紊亂都會導致惡性腫瘤的發生與進展。在本研究中我們檢測了一種線型四氫呋喃型香豆素苷類化合物紫花前胡苷對宮頸癌HeLa細胞的作用及相關信號通路，為宮頸癌治療藥物研發提供候選小分子單體結構。

本研究通過細胞增殖活性及細胞凋亡檢測實驗證實紫花前胡苷可抑制HeLa細胞增殖活性并促進凋亡率，并呈一定的劑量依賴效應關系。10 mmol/L的紫花前胡苷處理24 h組細胞的活力明顯下降、凋亡率明顯升高，因此后續實驗選用10 mmol/L處理24 h的實驗參數探索相關信號通路變化。凋亡和自噬是調節細胞新陳代謝以及細胞死亡的重要方式，是細胞應對各種損傷性刺激所作出的反應。本研究結果顯示，紫花前胡苷處理后HeLa細胞內凋亡信號通路被激活，表現為凋亡相關蛋白clecaspase3、Cyto C、Bax水平升高以及抗凋亡蛋白Bcl2表達下降。目前關于紫花前胡苷抗研究較少，有研究顯示紫花前胡苷可抑制TGF-β/Smad信號通路改善尿毒癥血清誘導的人腎小管上皮細胞轉分化，此外，還可通過NF-κB信號傳導通路抑制哮喘小鼠氣道炎性反應，但尚無對腫瘤作用的相關報道，其誘導宮頸癌細胞凋亡的機制尚不明確。有研究表明，呋喃型香豆素苷類化合物歐前胡素可激活細胞自噬，并在宮頸癌等多種腫瘤細胞中表現出較好的抗腫瘤及逆轉腫瘤耐藥效應。

自噬是廣泛存在于真核細胞中的一種新的程序性死亡形式，通過形成膜包被的自噬小體包裹細胞器及其他組成成分，隨后與溶酶體結合成自是溶酶體最終被降解完成“自我消化”過程，促進細胞的新陳代謝及細胞器更新。自噬與腫瘤的發生密切相關，其與凋亡的相互作用關系極為復雜，正常生理情況下，自噬利于細胞自穩狀態的維持；在應激發生時，自噬可防止有毒或致癌的損傷蛋白質和細胞器的累積，抑制細胞癌變，而HPV可通過抑制細胞自噬促進宮頸癌的發生發展；另一方面，自噬也為癌細胞提供更豐富的營養，促進腫瘤生長，紫杉醇可通過抑制宮頸癌細胞自噬進而抑制宮頸癌進展。因此，在腫瘤發生發展的過程中，自噬的作用具有兩面性。有研究表明自噬是凋亡的引發形式之一，自噬的過度激活能夠通過引起線粒體的損傷促進細胞死亡的發生。當線粒體過度被消化，或者線粒體膜電位通透性的持續提高，能夠通過線粒體膜電位不可逆的下降，釋放凋亡誘導因子等物質。在自噬調節的過程中，mTOR抑制后可以通過ULK1/2以及Beclin1促進自噬小泡的形成，而p62通過與LC3相互作用，被自噬溶酶體分選后降解，是自噬常見的標志分子。而紫花前胡苷引起宮頸癌細胞凋亡是否與自噬相關目前仍無相關報道，因此，本研究還檢測了自噬相關信號通路變化情況，結果顯示：紫花前胡苷處理后HeLa細胞后自噬相關mTOR信號通路中p-mTOR水平下降，Beclin1以及LC3-Ⅱ累積增多，自噬流相關蛋白P62表達下降，LC3B在紫花前胡苷處理組中呈顆粒性聚集，表明紫花前胡苷能夠促進HeLa細胞LC3的表型轉換及P62的降解，提示了紫花前胡苷誘導宮頸癌HeLa細胞凋亡的同時伴有自噬流的發生。

綜上所述，本研究初步探索了紫花前胡苷對HeLa宮頸癌細胞的作用及相關信號通路，明確了一定濃度的紫花前胡苷具有較好的抗宮頸癌細胞作用，且其機制可能與自噬相關細胞凋亡有關。但自噬是否是紫花前胡苷誘導HeLa凋亡的必要因素仍需進一步對自噬信號通路干預相關研究證實，此外，目前該研究尚停留在細胞層面，還需進一步從動物水平以及基因、代謝層面進一步闡述其治療作用及機制。