高效液相色譜-質譜-多反應監測特征輪廓譜結合化學計量學對市售不同產地藥用紫草的質量評價

廖梅

藥用紫草是紫草Lithospermum erythrorhizon Sieb.et Zucc（LE，俗稱硬紫草）、新疆紫草Arnebia euchroma（Royle）Johnst（AE）和內蒙古紫草Arnebia guttata Bunge（AG）的干燥根，收載于《中國藥典》，性味甘、咸寒，有涼血活血，解毒透疹之功效，用于治療血熱毒盛，斑疹紫黑，麻疹不透，瘡瘍，濕疹，水火燙傷等癥。作為藥用紫草的主要有效成分，紫草素類化合物具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等顯著藥理活性，還可作為天然色素應用于食品、醫藥等領域，應用開發前景巨大。紫草按產地分為國產，進口，按質地分為軟苗，硬苗。國產紫草的產地主要為新疆，偶見內蒙古，東北產地。近年來，隨著新疆紫草資源的減少，紫草商品主要以巴基斯坦等地進口為主，因受自然環境和種植采收標準等因素的影響，不同產地的紫草質量參差不齊，無論在形態學還是化學成分上均表現出顯著差異，給臨床安全有效用藥帶來挑戰，如何選用成為關鍵。中藥化學成分比較復雜，在鑒別上有一定難度，采用單一指標進行含量控制并不能從整體上反映紫草飲片的質量全貌。基于UHPLC-QTRAP-MRM技術的特征輪廓譜是在LC-MS/MS技術基礎上建立的能全面、特異性識別和表征一些結構性質相關成分的特殊指紋圖譜，能同時進行定性與定量分析，近年來已逐漸成為天然藥物質量控制的有效手段。因此，本文擬通過UHPLC-QTRAP-MRM技術建立紫草的特征輪廓譜，并對22批不同來源紫草進行主成分分析（PCA）、主成分判別分析（PCA-DA）和T檢驗分析，以期對市售不同來源藥用紫草藥材的整體質量進行評價，為該藥材的產地選擇及質量控制提供參考依據。

1 實驗儀器與材料

1.1 儀器 島津LC20ADXR高效液相色譜儀聯合AB SCIEX QTRAP4000質譜儀（配備MarkerView1.2.1軟件）；Mettler Toledo MS103DU電子分析天平。1.2 試藥 月旭Ultimate UHPLC XB-Ccolumn（100 mm×2.1 mm，1.8μm）；雙氯芬酸鉀（批號B25405，源葉生物）；色譜純甲醇、乙腈（美國Fisher公司）；分析純98%甲酸和甲酸銨（國藥集團化學試劑有限公司）。

藥用紫草飲片來自安徽省亳州市藥材市場，由嘉應學院張聲源副教授鑒定（表1）。

表1 藥用紫草樣品列表

2 方法與結果

2.1藥用紫草UHPLC-QTRAP-MRM特征輪廓譜的建立

2.1.1 供試品溶液的制備 各紫草樣品經粉碎后參考文獻方法制備得質控樣品（QC）和各供試品溶液，每批次樣品重復制備3份。

2.1.2 分析條件 本實驗采用LC20ADXR液相色譜儀聯合QTRAP4000質譜儀對樣品進行分析，運用MarkerView軟件提取數據，參數設置參考文獻［14］，采用雙氯芬酸鉀峰294.1/250.0/12.8校正后的峰面積構建變量數據矩陣，用于后續主成分分析，變量縮放方式均采用等方差法。

為了考察儀器系統的穩定性和色譜峰的重現性，參考文獻［15］方法設置QC進樣順序，結果顯示貫穿整個樣品批的QC樣品中各特征峰的相對峰面積和保留時間RT值的RSD值分別在3.1%～8.6%和0.1%～2.5%之間。說明系統重現性良好，測定變量的差異不是由儀器的不穩定造成的，而是由樣品本身的差異引起，見圖1。

圖1 QC樣品的總離子流色譜圖

2.1.3 藥用紫草UHPLC-QTRAP-MRM特征輪廓譜的建立 將22批紫草飲片按“2.1.2”項制得供試品溶液，按照“2.1.3”項下分析條件進樣測定，并記錄各批次樣品色譜數據，每個樣品重復進樣3針，參考文獻對各特征峰進行定性鑒別。

2.2 數據處理方法 采用MarkerView軟件提取數據的參數設置：高斯平滑寬度：3個點；噪音百分比：50.0%；基線扣除窗口：8.0 min；峰分裂因子：2個點；是否限制每張圖提一個峰：否；保留時間公差：0.50 min；最低峰強度：200 cps；最小峰寬度：4 points；最小信噪比：5.0；最大峰數目：500；采用內標雙氯芬酸鉀校正后的峰面積構建數據矩陣，用于主成分分析及主成分判別分析，變量縮放方式均采用等方差法。

2.3 基于主成分分析及主成分判別分析的紫草藥材質量評價 無監督的PCA模型（圖2A，2B）觀察樣品的自然聚集狀態，結果顯示新疆紫草分布于第一、二象限，硬紫草和內蒙古紫草分布于第四象限；但是各紫草樣品組內分布呈明顯分散趨勢，提示來源于不同產地紫草飲片所含化學成分的組成和含量顯著不同；另外硬紫草與內蒙古紫草相互靠近并集中在一處，說明就化學成分而言兩者可能更接近，該結果從化學成分方面驗證了市場上通常將內蒙古紫草也歸屬于硬紫草的做法有一定科學依據，也說明LC-MS/MS技術完全有可能作為傳統形態學鑒別的補充工具，通過表征化學成分應用于藥材品種的區分和鑒別。

PCA-DA模型（圖2C，2D）顯示新疆紫草分布于第一、四象限；硬紫草分布于第三象限，內蒙古紫草分布于第二象限，說明不同品種紫草化學成分的組成和含量表現出較大差異。此外，新疆紫草被投影在一個較大區域，硬紫草呈分散分布，區域分布的不同說明相同品種紫草化學成分也存在較大差異，但是內蒙古紫草的分布態勢需擴大樣本量后進一步觀察。眾所周知，中藥材的化學成分除受本身的遺傳物質影響外，還受產地自然條件、采收加工、炮制等環節的多方面影響。本實驗紫草樣品來源于中國新疆南部、中國新疆北部、巴基斯坦、阿富汗等6個產地，各地的日照時間，降水條件和土壤環境等差異造成藥材間的代謝成分差異較大。然而，產地的差異并沒有影響三個品種的分類趨勢，說明相對于外部生態環境因素，內部遺傳因素對藥材有效成分的影響更大。

為了發現可能的代謝差異物，找出引起三種紫草品種分類的內在原因，我們進一步觀察PCA-DA模型的載荷圖并對結果進行T檢驗分析（圖3）。結果發現新疆紫草的色譜峰65（β，β-二甲基丙烯酰紫草素）和色譜峰5（紫草呋喃A）的相對峰面積顯著低于其他兩種紫草（P＜0.001）；內蒙古紫草的色譜峰25（1-甲氧基乙酰紫草素）、色譜峰44（丙酰紫草素）和色譜峰21（紫草呋喃E）的相對峰面積顯著高于硬紫草（P＜0.001）。說明這些化合物為潛在的區分三種紫草的差異性代謝物。在經過大量樣本驗證并測定各化合物絕對含量的基礎上，首先根據化合物β，β-二甲基丙烯酰紫草素和紫草呋喃A的含量將新疆紫草與其他兩種紫草區分開來，然后利用化合物1-甲氧基乙酰紫草素、丙酰紫草素、紫草呋喃E的含量區分硬紫草和內蒙古紫草。

3 討論

傳統的形態學鑒別法主要是對天然藥物的自然形態、對炮制藥材的外表性狀進行觀察，通常沒有確實可靠的實驗數據作為支撐，主要取決于鑒定者的經驗進行，對于種內變異和種間雜交的鑒別大多模棱兩可。近年來，色譜技術作為形態學的補充工具，通過化學成分表征而廣泛地應用于植物品種的區分。來源于LC-MS/MS技術的UHPLCQTRAP-MRM特征輪廓譜尤其適用于復雜體系及微量成分的定性定量分析。本實驗首先構建不同來源紫草的UHPLC-QTRAP-MRM特征輪廓譜數據庫，然后采用主成分分析、主成分判別分析和T檢驗分析用于評價不同來源紫草資源。實驗結果表明不同基源紫草的種間、種內化學成分均不一致，說明影響紫草藥材的質量除了藥材本身的遺傳因素外，自然環境和采收標準等因素同樣不可忽視。T檢驗結果初步研究表明β，β-二甲基丙烯酰紫草素、紫草呋喃A、1-甲氧基乙酰紫草素、丙酰紫草素和紫草呋喃E可能為三種紫草的差異性代謝成分，該結論有待進一步深入研究證實。該研究為區分不同基源紫草飲片及其全面質量控制提供了科學數據。

圖2 藥用紫草的主成分分析圖：A為PCA得分圖；B為PCA載荷圖；C為PCA-DA得分圖；D為PCA-DA載荷圖

圖3 T檢驗分析及5個化合物的峰面積輪廓圖：A為T檢驗分析；B為β，β-二甲基丙烯酰紫草素；C為紫草呋喃A；D為1-甲氧基乙酰紫草素；E為丙酰紫草素；F為紫草呋喃E