siRNA靶向沉默人多梳基因2對鼻咽癌細胞增殖及細胞周期的影響

吳梅，楊麗，再努拉·艾未肉拉，唐亮

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是常見的頭頸部惡性腫瘤，東南亞和我國華南地區是高發區。鼻咽癌對放化療敏感，腫瘤局部和淋巴結復發病人預后差，與腫瘤細胞的耐藥和惡性增殖密切相關，探索相關的鼻咽癌增殖相關的驅動基因及信號通路，將有利于推進鼻咽癌的分子靶向治療。

人多梳基因（human polycomb，HPC）是多梳基因家族（The Polycomb Group of Protein，PcG）的成員，HPC有三個亞型，HPC1，HPC2，HPC3。HPC2又名染色框同源物4（chromobox homolog 4，CBX4），該基因定位于17q25.3，在不同腫瘤細胞中mRNA表達豐度差別很大，如在骨肉瘤（U2-OS）和結腸腺癌（SW480）含量高，在小細胞癌中的表達量卻很低。本課題組前期研究發現，鼻咽癌組織中HPC2高表達與病人不良預后密切相關，但其在鼻咽癌發生發展中的作用尚不清楚。因此，本研究旨在探討HPC2在鼻咽癌細胞增殖中的作用及對細胞周期的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞和實驗試劑

人鼻咽癌細胞株5-8F由江西省委腫瘤轉移與精準治療重點實驗室饋贈。RP‐MI-1640培養基和RNAi Max均購自Invitrogen公司。陰性對照siRNA及HPC2靶序列siRNA購自廣州銳博公司，#1-siRNA序 列（正向鏈）5’-AGAUGAAGAUAGUCAAGAA-3’；（反 向 鏈）5-UUCUUGACUAUCUUCA

UCU-3；#2-siRNA序 列（正向鏈）5’-AGUAC‐GAGCUCAACAGCAA-3’；（反 向 鏈）5-UUGCU‐GUUGAGCUCGUACU-3；scrambled為無干擾功能的對照序列。Nexcelom全自動計數儀進行細胞計數。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養和轉染 復蘇5-8F細胞，使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，在5%二氧化碳、37℃恒溫培養箱培養。轉染前1 d，胰酶消化對數生長期的細胞，接種細胞于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基的6孔板，使細胞在轉染日能夠達到70%融合度。采用細胞瞬時轉染（轉染試劑RNAi max），實驗分為對照組（scrambled）（轉染無功能對照siRNA）和兩個si-RNA組（轉染靶向HPC2的特異性siRNA）。各孔加入Optimum培養基1.5 mL，各孔按用EP管配制如下轉染液體系，A管：RNAimax 5μL+Optimum 250μL，輕彈混勻孵育5 min，B管：siRNA 5μL+Optimum 250μL，輕彈混勻并孵育5 min，A管液體加入到B管中，混勻后在室溫條件繼續孵育20 min。緩慢滴加入相應的細胞孔中，將6孔板輕微水平晃動，搖勻轉染液。放置入5%二氧化碳，37℃孵育箱中，間隔6 h后換液，DMEM培養基中加入10%胎牛血清繼續培養。

1.2.2 RT-qPCR及Western blot法檢測HPC2的siRNA干擾效率 RNA提取和RT-qPCR程序簡要步驟，用TRIzol法（Thermo Fisher Scientific，Inc.）提取細胞系總RNA，紫外分光光度計測RNA的純度和濃度。利用逆轉錄酶合成第一鏈cDNA。HPC2引物序列：正向引物5’-GCAGAGTGGAGTATCTGGTG

A-3’；反 向 引 物5’-AGCTTGGCACGGTTGT‐CAG-3’；GAPDH引物序列：正向引物5’-GGAGC‐GAGATCCCTCCAAAAT-3’反向引物5’-GGCTGTT‐GTCATACTTCTCATGG-3’。引物均購自中美泰和生物公司。在基因擴增儀CFX96（Bio-Rad Laborato‐ries，Inc）實 時 熒 光 定 量PCR檢 測，使 用SYBR?Green mix（Takara生物公司）進行qPCR反應，反應的條件：在95℃，預變性15 min，共40個循環（95℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s）。擴增產物用2法計算，每個樣品校準到內參基因GAPDH的相對表達水平。

檢測轉染siRNA-HPC2后的5-8F細胞的HPC2蛋白表達，簡要步驟如下：細胞經RIPA裂解液充分裂解后，收集并提取細胞的總蛋白，采用BCA法（試劑盒購自南京凱基Cat.no，23227）測定樣品蛋白含量；配平后用上樣緩沖液（4×loading buffer）加熱變性，上樣量為每孔30μg，經10%SDS-PAGE電泳分離，電轉膠中蛋白至PVDF膜，將膜用5%脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，用PBST清洗膜，一抗稀釋液配抗體HPC2（Bethly公司，Cat.no，A302-355A；1∶1000）和內參β-Actin（Bioworld公司，Cat.no，AP0060；1∶2 000），加入至孵育盒中的膜條帶上，4℃孵育過夜，充分洗膜，加稀釋的二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，搖床上洗膜3次，用化學發光法（ECL：Cat no.P0018F，碧云天公司）顯影后記錄呈圖片，用Image lab軟件比較蛋白相對表達量，實驗過程重復3次。

1.2.3 CCK8法檢測細胞增殖活性 將對照組和兩組轉染siRNA后的5-8F細胞懸液以每孔1×10接種于96孔板，每組5個復孔，于5%二氧化碳，37℃恒溫箱培養，分別收集0、24、48、72 h和96 h共5個時間點的細胞，檢測前用多孔移液器在每孔中加入CCK-8試劑（Cat no.C0038，碧云天公司）10μL，培養箱內孵育2 h，多功能酶標儀測定450 nm波長處的吸光度（OD）值，實驗重復3次。

1.2.4 平板克隆形成實驗 將每組細胞按3×10個/孔接種于6孔培養板，每組設3個復孔，2周后觀察克隆形成情況。皿底的細胞用PBS輕柔清洗，經4%多聚甲醛固定，1%結晶紫室溫染色1 h，經PBS潤洗、干燥后，在顯微鏡下（放大倍數，×100）計數細胞克隆數并拍照，≥50個細胞計為1個克隆，計數克隆形成總數，實驗重復3次。

1.2.5 細胞周期測定 三組5-8F細胞分別接種于6孔培養板，采用胸腺嘧啶核苷雙阻斷法將各組細胞同步化至G0期，解除阻滯后，分別收集各組在0、3、6 h共3個時間點的細胞，離心，去掉上清液，PBS洗滌后，輕柔重懸呈單細胞懸液，將各組細胞固定于70%預冷乙醇中，在-20℃冰箱過夜。檢測前，去除固定液，加入4 mL的PBS混勻，離心棄上清，加入含有50μg/mL碘化丙啶PI，RNase（50μg/mL）Triton（1%通透細胞膜）液200μL，室溫避光孵育15 min。上機檢測各組細胞周期分布，實驗重復3次。

2 結果

2.1 鼻咽癌5-8F細胞中siRNA轉染效率及細胞活性檢測

#1siRNA，#2 siRNA轉染組與對照組5-8F細胞HPC2的mRNA相對表達量分別為（0.94±0.05）（0.25±0.06），（0.20±0.04），與對照組相比，兩個轉染組HPC2的mRNA豐度降低，差異有統計學意義（F=199.909，P=0.000）。相應地，轉染組的HPC2蛋白表達水平較對照組下調。見圖1。

兩個轉染組在第2、3、4、5天細胞活性的吸光度OD值 分 別 為（0.147±0.04、0.150±0.05），（0.255±0.03、0.200±0.05），（0.436±0.04、0.327±0.05），（0.631±0.03、0.479±0.04），均低于對照組，尤其在第4、5天的差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖1 Western-blotting檢測siRNA對各組5-8F細胞HPC2蛋白表達

2.2 平板克隆形成

#1siRNA，#2 siRNA轉染組每孔細胞克隆形成數量分別為（65.0±16.5）個/孔和（52.5±14.6）個/孔，低于scrambled對照組（182.6±17.3）個/孔，差 異 有 統 計 學 意 義（F=59.644，P=0.000）。

2.3 細胞周期G1/S時相轉換

利用流式細胞儀分別檢測三組5-8F細胞在0、3、6 h時間點的周期分布。分析顯示：在0點時各組細胞約95%同步化至G1期。在3h時間點各組G1/S時相轉換逐漸增多，在6 h時間點顯示：對照組、#1siRNA，#2 siRNA轉染組處于G1期的細胞所占的比例分別為（8.56±0.91）%、（26.57±1.29）%、（23.41±1.01）%；處于S期分別為（20.34±0.89）%、（32.48±1.03）%、（30.50±0．93）%；處于G2/M期分別為（71.97±1.20）%、（41.34±1.26）%、（46.38±1.24）%。轉染組與對照組相比，處于G1期的細胞占比多，轉染組G1/S時相轉換減緩，差異有統計學意義（F=236.968，P=0.000）。

3 討論

腫瘤細胞無限增殖和細胞周期調節紊亂是惡性腫瘤的重要特征，PcG多梳蛋白組在細胞自我更新，細胞周期調控，腫瘤形成中發揮著重要作用。HPC2是重要的PcG成員，編碼蛋白含558個氨基酸，羧基端是該蛋白發揮抑制功能必需的結構域。據報道HPC2生理功能包括調節胚胎定向發育，胸腺上皮增殖，維持胸腺功能，介導造血干細胞更新分化，參與脂肪組織熱生成。HPC2與多種腫瘤的發生發展密切相關。

小泛素樣修飾分子E3（small ubiquitin-like mod‐ifier E3，SUMO E3）具有泛素連接酶活性，這是HPC2區別于其他PcG蛋白的一個重要特點。HPC2對底物有SUMO化作用，可以介導HIF-1α的SUMO化，誘導肝細胞癌血管生成，促進腫瘤進展。介導KDM5B翻譯后的SUMO化修飾，抑制細胞周期及DNA修復基因的功能。

越來越多的證據表明，HPC2在不同腫瘤中的作用具有腫瘤特異性且功能極其復雜。HPC2能促進肝癌細胞肺轉移；與骨肉瘤的生長密切相關；通過調節BMI1促進肺癌增殖轉移。CBX4可以在轉錄水平發揮基因轉錄抑制作用，如乳腺癌中結合到mi137啟動子抑制其表達，激活Notch1通路，促進腫瘤生長轉移。與此相反的是，CBX4通過招募HDAC3至RUNX2啟動子抑制其轉錄，進而抑制腸癌轉移。本研究發現：通過siRNA靶向敲低鼻咽癌5-8F細胞內源性HPC2后，細胞的增殖活性較對照顯著降低。腫瘤細胞克隆形成率反映的是細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀，本研究發現沉默HPC2組的細胞克隆形成數目明顯減少，表明鼻咽癌5-8F的增殖能力減弱。

HPC2可以通過多途徑介導惡性腫瘤細胞周期調控。miR-497-5p通過直接靶向CBX4，降低CDK2和細胞周期蛋白A2的表達，將細胞阻滯于S期，從而抑制宮頸癌細胞增殖。p38MAPK通過磷酸化HPC2介導轉錄抑制，調節細胞周期進程，參與了砷酸鹽誘導骨肉瘤U2OS細胞G2期阻滯。本研究流式細胞周期檢測發現：HPC2沉默后，5-8F細胞周期G1/S時相轉換較對照組明顯減緩，以上證據表明HPC2參與了鼻咽癌細胞的增殖及周期調控。在鼻咽癌中HPC2的下游靶基因以及具體信號調控機制還需要進一步研究。

總之，本研究結果顯示靶向沉默HPC2表達抑制了鼻咽癌細胞增殖及克隆形成能力，延緩了G1/S時相轉換。本研究的局限性是只選5-8F細胞系進行了初步的體外實驗。今后的實驗將構建HPC2過表達的鼻咽癌細胞模型，進一步在其他表型方面探索，最終通過動物體內實驗驗證HPC2在鼻咽癌中的生物學功能，為鼻咽癌的分子靶向治療提供實驗依據。