下調HOX轉錄反義RNA對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖、周期及侵襲能力的影響

葉惠榮，張玉娟，曹茵，王西躍，吳麗華，陳桂林，陳麗娟，袁惠玲

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TN‐BC）病人雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）表達均為陰性，約占乳腺癌的17%。TN‐BC因缺少PR、ER、HER2的表達，不能接受分泌治療和抗HER2治療的手段，目前臨床上主要依賴化療，但其乳腺癌細胞具有強轉移和侵襲能力，導致相對其它類型乳腺癌，TNBC整體預后仍差。由于缺乏明確的治療靶點，因此越來越多學者關注TNBC治療靶點的研究。長鏈非編碼RNA（Long Non-coding RNA，lncRNA）長度一般為200個核苷酸序列，不編碼蛋白質，在X染色體滅活、染色質重塑、轉錄調節、細胞周期調控、MicroRNA活性、表觀基因調節等生物過程均發揮重要作用。lncRNA HOX轉錄反義RNA（HOX Transcript Antisense RNA，HO‐TAIR）能夠通過反式作用調節基因的表達。研究發現，HOTAIR在TNBC組織中表達水平升高，與TNBC的臨床病理分期相關。但HOTAIR對TNBC細胞調控機制尚不清楚，本研究自2019年2—7月以TNBC細胞MDA-MB-231為模型，探究下調HO‐TAIR表達水平對MDA-MB-231細胞增殖、周期及侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 RPMI 1640培養基（貨號：C11875500BT）、胎牛血清（FBS）（貨號：10091-148）均購自美國GIBCO公司；轉染試劑Lipofectamine 2000（貨號11668019）購自武漢科昊佳生物科技有限公司；陰性對照si-Control、si-HOTAIR由上海吉瑪公司合成；兔抗人c-myc（貨號BS94081）、兔抗人Ki-67（貨號BS90768）、兔抗人PCNA（貨號BS6438）、兔抗人MMP-9（貨號BS6893）、兔抗人MMP-2（貨號BS72289）、兔抗人內參β-Actin（貨號：AP0060）均購自美國Bioworld公司；羊抗兔二抗（貨號31466）購自美國Pierce公司；RNA提取試劑Trizol（貨號15596026）購自英濰捷基（上海）貿易有限公司；PrimeScript逆轉錄-PCR試劑盒（貨號DRR042A）購自南京賽鴻瑞生物科技有限公司；FC 500系列流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特有限公司；Multiskan FC酶標儀購自美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 細胞培養和轉染 細胞系：正常乳腺上皮細胞系MCF-10A、TNBC細胞系MDA-MB-231購自南京安研生物科技有限公司。MCF-10A細胞、MDA-MB-231細胞在相對濕度98%、5%二氧化碳、溫度為37℃的培養箱中常規培養，培養液為含有1%青鏈霉素雙抗、10%FBS的1640培養基，待細胞單層平鋪培養瓶約80%時胰酶消化傳代，收集對數生長期的細胞進行后續實驗。細胞轉染：實驗分為對照組、si-陰性對照組、si-HOTAIR組。嚴格按照說明書操 作 將si-HOTAIR（5'-GAACGGGAGUACAGAGA‐GAUU-3'）和陰性對照si-Control（5'-TTCTCCGAAC‐GTGTCACGT-3'）轉染至MDA-MB-231細胞中，細胞在6孔板中培養48 h后用做后續實驗。

1.3 RT-qPCR檢測MDA-MB-231細胞HOTAIR表達水平 使用RNA提取試劑Trizol提取各組細胞總RNA，PrimeScript逆轉錄-PCR試劑盒反轉錄得到cDNA，嚴格按照PCR試劑盒說明書操作，將cDNA稀釋至25 ng/mL，然后加入到反應體系中，使用PCR儀對HOTAIR進行擴增。HOTAIR正向引物序列：5’-GGGTGTTGGTCTGTGGAACT-3’，反向引物序列：5’-CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3’；內參GAP‐DH正 向 引 物 序 列：5’-CTTTGGTATCGTG‐GAAGGACTC-3’，反 向 引 物 序 列：5’-CAGT‐GGGGAACTCTGACTCG-3’，反應條件：首先在94℃條件下預變性300 s，隨后94℃條件下變性30 s，65℃退火1 min，最后在60℃條件下延伸30 s，進行30個循環，60℃終末延伸5 min。各組設置6個復孔，采用2法對MDA-MB-231細胞HOTAIR表達水平進行定量分析。

1.4 MTT法測定MDA-MB-231細胞活性 將細胞以1×10個/孔接種到96孔板上，實驗分組同“1.2”，每組設置6個復孔，培養過夜，待細胞貼壁后棄培養液，PBS清洗3次，加入不含血清的培養液繼續培養。培養48 h后加入25μL MTT（5 mg/mL）溶液，孵育4 h后棄去孔內培養液，加入150μL DMSO溶液，100 r/min 37℃恒溫震蕩10 min，使用多功能酶標儀測定樣品在570nm處吸光度（OD值）。根據公式計算細胞活性。細胞活性（%）=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD-空白組OD）×100%。

1.5 流式細胞儀測定MDA-MB-231細胞周期 收集MDA-MB-231細胞，實驗分組同“1.2”，設置6個復孔，離心后用預冷的PBS清洗3次，之后將細胞置于4℃70%乙醇中固定0.5 h，用預冷的PBS清洗3次，最后將細胞重懸于含有100μg RNaseA和40μg PI的PBS中，25℃避光孵育0.5 h，用流式細胞儀測定。

1.6 Transwell小室侵襲實驗測定MDA-MB-231細胞侵襲能力 將Matrigel膠從-20℃冰箱中取出，4℃環境中過夜解凍，用1640培養液稀釋至200μL/mL，之后涂抹到transwell板的濾膜上面（200μL/cm），37℃放置3 h，取出后在超凈臺上干燥過夜。按照“1.2”實驗分組處理，設置6個復孔，將細胞以1×10個/孔接種到上室，同時下室加入600μL不含細胞的培養液，常規培養，待細胞貼壁后更換上室培養液，然后繼續培養48 h，用棉簽輕輕擦去Matri‐gel和上室內細胞，甲醇固定5 min，然后用PBS清洗3次，0.1%結晶紫染色5 min，PBS清洗3次后顯微鏡下拍照，每組隨機選擇6個視野計數，取平均值。

1.7 蛋 白 印 跡 法（western blotting，WB）測 定MDA-MB-231細胞c-myc、Ki-67、PCNA、MMP-9、MMP-2表達水平 使用RIPA法提取各組細胞蛋白并測定總蛋白含量，垂直電泳法分離所需目標蛋白，用BIO-RAD法將目標蛋白轉至PVDF膜上，5%BSA將結合位點封閉1 h。加入兔抗人c-myc、兔抗人Ki-67、兔抗人PCNA、兔抗人MMP-9、兔抗人MMP-2、兔抗人內參β-Actin（稀釋比例均為1∶1 000），4℃孵育過夜，加入羊抗兔二抗（1∶1 000），PBS清洗3次，37℃孵育0.5 h，PBS清洗3次，顯色、曝光、凝膠成像設備觀察。

1.8 統計學方法 使用SPSS22.0版軟件對數據進行統計分析。數據以x±s表示，多組比較行單因素方差分析，兩組均數相比行snk-q檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組MDA-MB-231細胞HOTAIR表達水平比較 與MCF-10A細胞組（1.06±0.13）相比，對照組MDA-MB-231細胞HOTAIR基礎表達水平（1.85±0.21）升高（P＜0.05）。與對照組相比，si-HOTAIR組HOTAIR表達水平（1.34±0.15）降低（P＜0.05），si-陰性對照組（1.80±0.31），差異無統計學意義。

2.2 各組MDA-MB-231細胞活性比較 與對照組（102.64±3.29）%相比，si-HOTAIR組MDA-MB-231細胞活性（98.04±6.28）%降低（P＜0.05），si-陰性對照組（81.93±5.87）%無明顯變化，差異無統計學意義。

2.3 各組MDA-MB-231細胞周期比較 與對照組相比，si-HOTAIR組MDA-MB-231細胞G0/G1期下調，主要阻滯在G2/M期，si-陰性對照組無明顯變化，見圖1。

圖1 MDA-MB-231細胞周期：A為對照組；B為si-陰性對照組；C為si-HOTAIR組

2.4 各組MDA-MB-231細胞侵襲能力比較 與對照組相比，si-HOTAIR組MDA-MB-231細胞通過Matrigel到達濾膜底層的細胞數A明顯減少［（35.66±8.04）個比（125.92±13.55）個，P＜0.05］，si-陰性對照組［（128.17±16.53）個］，差異無統計學意義。

2.5 各組MDA-MB-231細胞中c-myc、Ki-67、PCNA、MMP-9、MMP-2表達水平比較 與對照組、si-陰性對照組相比，si-HOTAIR組c-myc、Ki-67、PC‐NA、MMP-9、MMP-2表達水平降低（P＜0.05），si-陰性對照組差異無統計學意義，見圖2和表1。

圖2 MDA-MB-231細胞中c-myc、Ki-67、PCNA、MMP-9、MMP-2表達水平

3 討論

TNBC相比其它類型乳腺癌，治療及預后、基因表型和生物學行為有明顯差異。研究發現TNBC病人3～5年期間生存率較低，10年后復發率與其它乳腺癌病人相當。因此，盡管TNBC侵襲性能力強，預后差，但如能找到合適的治療靶點，TNBC仍有望臨床治愈。

近幾年，HOTAIR在乳腺癌組織中異常表達受到越來越多研究者的關注，研究發現，HOTAIR在TNBC病人外周血清和癌組織中表達水平升高，且在轉移性TNBC病人中尤其高。乳腺癌組織中HOTAIR高表達，上調MCF-7細胞中HOTAIR表達水平后，細胞侵襲能力增強，提示HOTAIR高表達有助于提高乳腺癌細胞侵襲能力。李苗等構建MDA-MB-231細胞三維培養體系，發現RNA-HO‐TAIR表達水平升高。本研究證實，與MCF-10A細胞組相比，MDA-MB-231細胞中HOTAIR表達水平升高，說明在MDA-MB-231細胞中HOTAIR高表達，提示HOTAIR可能與TNBC有關。Liu等研究發現HOTAIR在肺癌組織和細胞系中的高表達，敲除CAV-1后能夠下調HOTAIR表達水平，抑制肺癌細胞增殖和侵襲，提示HOTAIR有望成為治療肺癌的新靶點。朱意等研究表明lncRNA-HOTAIR在前列腺癌癌組織中高表達，與前列腺癌細胞的生長及侵襲能力有關，使細胞G2期阻滯，G1期的下調。另有研究發現，HOTAIR-siRNA組子宮內膜癌細胞增殖水平、侵襲能力與遷移能力低于對照組和陰性對照組，提示lncRNA-HOTAIR參與子宮內膜癌的轉移侵襲進程。本研究表明，與對照組、si-陰性對照組相比，si-HOTAIR組MDA-MB-231細胞活性、侵襲能力降低，細胞G0/G1期下調，主要阻滯在G2/M期，說明下調HOTAIR表達水平可抑制MDA-MB-231細胞增殖、阻滯細胞周期、降低侵襲能力，提示HO‐TAIR可能成為治療TNBC的新靶點。

表1 MDA-MB-231細胞中c-myc、Ki-67、PCNA、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、基質金屬蛋白酶2（MMP-2）表達水平/x±s

c-myc作為位于細胞核的原癌基因，具有誘導細胞增殖、分化、凋亡等作用，研究發現，下調抑制cmyc蛋白表達，可抑制TNBC細胞增殖。Ki-67蛋白具有200多個磷酸化部位，易受到相關蛋白酶作用，Ki-67蛋白是癌細胞增殖過程中必需的結合蛋白，是臨床上常用評價細胞增殖標志物。PCNA在細胞核特異性表達，與細胞增殖活性相關，研究發現，抑制PCNA蛋白表達水平，能夠抑制肝癌細胞增殖。本研究表明，與對照組、si-陰性對照組相比，si-HOTAIR組MDA-MB-231細胞中c-myc、Ki-67、PCNA蛋白表達水平降低，說明下調HOTAIR表達水平可能抑制c-myc、Ki-67、PCNA蛋白表達，提示下調HOTAIR可能通過降低c-myc、Ki-67、PCNA蛋白表達水平而抑制MDA-MB-231細胞增殖。基質金屬蛋白酶（MMP）能夠降解細胞外基質和基底膜促進腫瘤細胞侵襲和遷移，研究發現，miR-125a-5p能夠通過調控PI3K/Akt信號通路，下調MMP-2、MMP-9表達水平，從而抑制乳腺癌細胞侵襲和遷移。楊彧、付雯研究發現TAGLN基因過表達可能通過下調MMP-2、MMP-9表達水平，從而抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲。本研究表明，與對照組、si-陰性對照組相比，si-HOTAIR組MDA-MB-231細胞中MMP-9、MMP-2蛋白表達水平降低，說明MMP-9、MMP-2蛋白表達水平可能受HOTAIR調控，提示下調HO‐TAIR水平使MDA-MB-231細胞侵襲能力下降可能通過抑制MMP-9、MMP-2蛋白表達實現。

綜上所述，HOTAIR在MDA-MB-231細胞中高表達，下調HOTAIR表達水平可抑制MDA-MB-231細胞增殖、阻滯細胞周期、降低細胞侵襲能力。但是具體通過調控哪種信號通路影響MDA-MB-231細胞還有待進一步研究。