肥胖2型糖尿病模型OLETF大鼠不同病程階段肝臟水通道蛋白9 mRNA的表達

段玉敏，袁振芳

水通道蛋白（aquaporin，AQP）是廣泛存在于多種細胞的細胞膜上的一大類跨膜蛋白，其主要作用是用來運輸水分子。目前已經發現的水通道蛋白有11個亞型（AQP0～AQP10）。本實驗研究的AQP9主要是在肝細胞表面表達的一種特異性水-甘油通道蛋白，其與在脂肪細胞表面表達的特異性水-甘油通道蛋白AQP7在糖脂代謝過程中存在協同作用。既往研究證實AQP7和AQP9可能在肥胖和糖尿病發展的不同病程階段發揮了一定作用，目前這兩類蛋白與糖脂代謝的關系還不十分清楚。本研究自2019年3-9月采用肥胖的2型糖尿病大鼠模型-OLETF大鼠作為研究對象，從動物角度揭示肝臟AQP9在肥胖和糖尿病病程發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及實驗方法 選取30只雄性OLETF（Otsuka Long-Evans Tokushima fatty）大鼠為實驗組，同品系的18只LETO（Long-Evans Tokushi‐ma Otsuka）大鼠為正常對照組。給予常規飼料喂養，飲用清水至8周齡，從兩組中分別隨機抽取6只予50%葡萄糖按2 g/kg劑量口服行葡萄糖耐量試驗（OGTT），同時測定體質量、胰島素、三酰甘油、總膽固醇水平，試驗后3 d稱重，給予2%戊巴比妥40 mg/kg腹腔內注射處死取肝臟組織凍存。剩余24只OLETF大鼠隨機分成兩組，一組為未治療組（OLETF組）12只，給予等體積純凈水6.0 mL/kg灌胃；另一組為鹽酸二甲雙胍治療組（OLETF/M組）12只，給予鹽酸二甲雙胍300 mg·kg·d灌胃。同時對照組的12只LETO大鼠按照6.0 mL/kg給予等體積的純凈水灌胃。自8周起，所有實驗大鼠均飲用100 g/L的蔗糖水代替普通飲用水，仍使用常規飼料喂養。在18周齡和28周齡，分別從三組中采用隨機數字表法抽取6只大鼠仍以50%葡萄糖按2 g/kg劑量口服行葡萄糖耐量試驗。符合OGTT 120 min血糖＞11.1 mmol/L或血糖峰值＞16.71 mmol/L兩條中的任何一條診斷為糖耐量異常；OGTT 120 min血糖＞11.1 mmol/L和峰值血糖＞16.71 mmol/L兩個條件都符合診斷為糖尿病；同8周基線時一樣測定大鼠的各項生化指標。OGTT試驗后3 d處死取肝臟組織凍存。實驗中充分保證動物福利、給予動物人道關懷，動物處置符合倫理學原則。

1.2 基本生化指標的測定 用氧化酶法測定血糖及血脂，血糖分別測定，血脂為同一批測定；用胰島素放射免疫分析試劑盒同一批測定血清胰島素。

1.3 肝臟組織AQP9 mRNA的表達用Real time PCR分批測定 取100 mg肝臟組織在液氮下研磨后用Trizol提取總RNA，逆轉錄為cDNA。取4μL cDNA（50μL體系）在ABIPrism 7600定量PCR儀上進行Real time PCR，實驗條件：預變性95℃10 min；95℃變性15 s，60℃退火1 min，共擴增40個循環。擴增曲線用7300 SDS軟件觀察，并進行產物定量分析。試驗組相對于對照組的變化倍數用2法表示。引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列

2 結果

2.1 三組大鼠體質量、三酰甘油、總膽固醇指標比較 見表2。

2.1.1 體質量 隨周齡增加，OLETF組較LETO組肥胖加重，8周體質量增加11.16%（P＜0.05），18周體質量增加17.47%（P＜0.01），28周體質量增加26.92%（P＜0.01），OLETF/M組與同周齡OLETF組大鼠比較，兩組體質量差異無統計學意義，與同周齡對照LETO組大鼠比較肥胖加重，未見鹽酸二甲雙胍對體質量有明顯影響。

表2 三組大鼠體質量、三酰甘油、總膽固醇指標比較/±s

2.1.2 三酰甘油及膽固醇 三酰甘油水平：8周齡OLETF組與對照LETO組差異無統計學意義，18周OLETF組較LETO組增高2.86倍（P＜0.01），28周OLETF組較LETO組增高7.58倍（P＜0.05）；而OLETF/M組在18周較LETO組僅增加2.31倍（P＜0.01），在28周較LETO組僅增加3.66倍（P＜0.05），18和28周OLETF/M組的三酰甘油水平均低于OLETF組（P＞0.05）。膽固醇水平：OLETF/M組在28周齡較OLETF組下降24.2%（P＜0.05），其余各周齡各組間差異無統計學意義。

2.2 三組大鼠各周OGTT血糖及胰島素比較見表3。

2.2.1 血糖 實驗期間對照組LETO大鼠血糖均正常；OLETF組在8周齡血糖正常，OLETF組及OLETF/M組在18周齡均達糖尿病診斷標準，血糖水平OLETF/M組低于OLETF組，在OGTT 60 min時差異有統計學意義（P＜0.01）。在28周齡，OLETF組血糖進一步增高，糖尿病加重，OLETF/M組大鼠血糖下降，均恢復為糖耐量異常。

2.2.2 胰島素 8周齡各組大鼠胰島素水平相同；隨血糖增高，糖尿病加重，OLETF組和OLETF/M組的胰島素水平均高于LETO組，說明OLETF大鼠胰島素抵抗加重。但OLETF與OLETF/M兩組間的胰島素在各點均差異無統計學意義，雖然在28周OLETF/M組服用鹽酸二甲雙胍使血糖水平緩解為糖耐量異常，但截至28周結束未觀察到二甲雙胍降胰島素的作用。

2.3 肝臟AQP9 mRNA的表達 OLETF組肝臟AQP9 mRNA的表達在8周齡、18周齡及28周齡分別是同周齡LETO組的0.9倍、1.0倍和0.7倍，OLETF/M組肝臟AQP9 mRNA的表達則分別是同周齡LETO組的0.9倍、0.6倍及0.5倍。OLETF/M組肝臟AQP9 mRNA的表達低于OLETF組，但兩組之間及與同周齡LETO組間對比差異無統計學意義。

3 討論

1997年Kuriyama等在分析人類脂肪組織基因序列時發現了一類水甘油通道蛋白-水通道蛋白9（AQP 9），它在肝臟、大腦、消化道、睪丸等多個組織分布，對水、多元醇、甘油、腺嘌呤、尿素、單羧酸酯、嘧啶、氨以及亞砷酸鹽等均具有通透性。AQP9基因最初是從脂肪組織中克隆得到的，它的生理功能是甘油進出脂肪細胞的通道，參與三酰甘油的合成代謝及分解代謝以維持脂肪代謝的平衡。在全身各組織器官中，AQP9在肝臟中的表達水平最高，免疫熒光顯示AQP9蛋白主要定位于肝細胞血竇面。甘油是體內聯系葡萄糖、脂肪、蛋白質三大物質代謝的樞紐，它既與脂肪酸作用參與三酰甘油等脂質合成，也參與糖異生過程。生理條件下70%～90%的甘油最終在肝細胞內氧化分解，而AQP9是肝細胞對甘油攝取的轉運通道。

脂肪組織分解產生的甘油通過脂肪細胞表面的水通道蛋白7（AQP 7）釋放入血，進入血液的甘油通過肝臟表面的AQP 9轉運入肝細胞，在糖脂代謝過程中，AQP7與AQP9的協同作用至關重要。水通道蛋白7和9把脂肪分解產生的甘油轉運到肝細胞胞漿內，在甘油激酶作用下生成3-磷酸甘油，它是體內多種能量物質代謝的中間產物，并參與氧化供能，3-磷酸甘油通過糖異生生成葡萄糖或者被再次合成三酰甘油。AQP9基因被敲除的AQP9小鼠與野生型AQP9小鼠相比，血甘油及三酰甘油明顯升高，饑餓狀態下的血糖明顯下降，說明AQP9參與了甘油的轉運，在糖代謝過程中也發揮了重要作用。

表3 三組大鼠OGTT血糖及胰島素比較/±s

本研究選擇肥胖2型糖尿病模型OLETF大鼠，給予高糖飼養后取肝臟組織，大鼠在喂養到18周齡時全部達糖尿病標準，血清三酰甘油和胰島素均增加，是典型的2型糖尿病病人具有的肥胖、高脂血癥和胰島素抵抗的特點。與文獻報道相符。

實驗觀察到OLETF大鼠在8周時肝臟AQP9 mRNA的表達是同周齡LETO組的0.9倍，在18周齡和28周齡，OLETF組肝臟AQP9 mRNA的表達分別是同周齡LETO組的1.0倍及0.7倍。同時在糖尿病發展過程中，LETO組AQP9 mRNA表達為逐漸上調趨勢，而OLETF組肝臟AQP9 mRNA表達則為先代償性上調而后下調趨勢。分析原因，這可能是由于LETO組大鼠隨著周齡及體質量的增加，脂肪含量增加使脂肪組織分解代謝增強，需要釋放入血的甘油濃度增加，肝臟AQP9 mRNA表達代償性上調，可以促進更多的甘油進入肝臟合成三酰甘油。而OLETF組AQP9 mRNA表達先代償性上調而后下調，可能是因為18周齡時因持續給予高糖飼養，大鼠體質量增加了17.47%，脂肪細胞需釋放更多甘油引起AQP9代償性上調，釋放的甘油是糖異生的底物，大量甘油進入肝臟合成葡萄糖，使OLETF大鼠血糖大幅升高，糖尿病加重。在28周齡，OLETF組大鼠的肥胖狀態及糖尿病加重，但肝臟AQP9表達卻呈現下調，既往國內外動物實驗及人體實驗均證實，肥胖者體內脂肪組織AQP7表達下調，故分析AQP 9下調可能是由于脂肪細胞AQP7失代償使表達減少，導致從脂肪細胞中排出的甘油減少，細胞內甘油濃度增加，脂肪細胞內脂肪合成增加，肥胖更加明顯，AQP7表達下調，從而使由脂肪細胞釋放的甘油減少進而導致肝臟AQP9表達同時下調。

鹽酸二甲雙胍是臨床2型糖尿病病人治療的基礎用藥，已有證據表明鹽酸二甲雙胍可以改善肥胖及2型糖尿病病人的胰島素抵抗及脂代謝紊亂，且有較強的降糖效果，在不增加胰島素分泌的同時可以改善胰島素抵抗，使體質量不變或減輕。本實驗選取鹽酸二甲雙胍，意在探討其在改善胰島素抵抗，治療糖尿病的同時能否影響肝臟AQP9 mRNA的表達。用鹽酸二甲雙胍以300 mg·kg·d劑量給OLETF/M組大鼠灌胃，到28周齡，鹽酸二甲雙胍降低了OLETF/M組大鼠的血糖及血脂，與文獻報道相符，但OLETF/M組體質量較同周齡OLETF組未見減輕，分析可能與飼養時間短有關，若延長飼養時間兩組間可能會出現差異。鹽酸二甲雙胍使同周齡OLETF/M組肝臟AQP9 mRNA表達上調的幅度低于OLETF組（P＞0.05），雖兩組間無統計學差異，但也表明鹽酸二甲雙胍既改善了糖脂代謝紊亂又抑制了肝臟組織AQP9的表達。為研究鹽酸二甲雙胍治療肥胖與胰島素抵抗的生理機制提供了新證據。

綜上所述，肝臟組織的AQP9參與了肥胖和糖尿病的發生發展，鹽酸二甲雙胍既可以改善OLETF大鼠的糖脂代謝紊亂，又可以抑制AQP9 mRNA的表達。對水甘油通道蛋白中甘油代謝機制的研究，可以為治療代謝綜合征提供新方法。