LSS和HMGCR基因的單核苷酸多態性與年齡相關性白內障的關系

鄒 茜，鄧國華，張 駿，顧珊珊，戎 晗，康麗華，王 勇，管懷進

0引言

年齡相關性白內障(age-related cataract,ARC)是我國乃至全球范圍內首位致盲性眼病[1-2]。ARC的病因和發病機制至今仍不清楚，許多研究表明膽固醇代謝異常可能與白內障發生發展相關[3-4]。研究發現，膽固醇的上游底物羊毛甾醇可以減少晶狀體的蛋白質聚集，減少白內障的形成[5-7]。羊毛甾醇的合成過程中最關鍵的限制酶是羊毛甾醇合成酶(LSS)和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)[8-12]。前期研究表明DNA修復基因中的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)與ARC相關[13-14]。在本研究中，我們選擇了LSS和HMGCR基因的4個SNP位點(rs2968，rs9980968，rs12916，rs17238484)，并進行了病例對照研究，以探討這4個SNP與ARC之間的關系。

1對象和方法

1.1對象流調人群選擇2014年江蘇眼病啟東縣及阜寧縣研究基地[15]。晶狀體混濁程度按LOCSⅢ分級系統進行分級[16]。ARC入選標準：(1)晶狀體混濁；(2)最佳矯正視力<0.5；(3)年齡≥50歲。排除標準：(1)糖尿病、葡萄膜炎、青光眼、高度近視、眼部外傷或者其他原因所引起的白內障；(2)雙眼中有一眼為無晶狀體眼。

對照組的入選標準：(1)晶狀體透明；(2)最佳矯正視力>0.5；(3)年齡≥50歲。排除標準：(1)患有葡萄膜炎、青光眼、近視、晶狀體脫位、黃斑疾病等其他眼病；(2)患有糖尿病、癌癥、腎臟疾病、自身免疫病等全身性疾病。并且要求對照組與ARC組患者性別及年齡均匹配。在知情同意的情況下，采集外周靜脈血。本研究通過南通大學附屬醫院倫理委員會批準。所有人群均被告知研究意義并簽訂了知情同意書。流調人群研究對象一般資料見表1。

表1 流調人群對照組與ARC組一般資料

本研究還從常州市第三人民醫院眼科2018-08/2019-08住院期間選取了40例ARC患者(皮質型、核型、后囊下型、混合型各10例)和10例進行晶狀體摘除+玻璃體切除術的囊膜透明患者。兩組無年齡、性別差異(P>0.05)。在知情同意的情況下，手術時收取晶狀體囊膜[含晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells, LECs)]，用以測量LECs的目標基因mRNA表達量。研究通過常州市第三人民醫院倫理委員會批準。研究對象一般資料見表2。納入標準和排除標準同流調人群。

表2 住院人群對照組與ARC組一般資料

1.2方法

1.2.1外周血DNA提取采用苯酚/氯仿/異戊醇法提取外周血中基因組DNA，并用Nanodrop測定所有血樣DNA濃度和純度，取OD260/OD280比值1.6～1.9純度要求的DNA。將DNA濃度稀釋到50μg/mL，登記后放入-20°C冰箱保存備用。

1.2.2篩選相應SNPs通過NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)選取LSS及HMGCR的SNPs，所選位點滿足在北京的中國漢族人群中最小等位基因頻率(MAF)≥10%，并且利用在線工具(http://www.broadinstitute.org/mpg/snap)排除高度連鎖不平衡(r2≤0.8)4個SNPs位點，見表3。

表3 SNPs位點信息

1.2.3檢測基因型采用TaqMan RT-PCR法對所有SNPs位點進行檢測。TaqMan探針是一段寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。每個SNPs位點分別以雙探針(VIC和FAM)熒光信號判定目的基因所含的野生位點和變異位點，在PCR反應過程中，探針攜帶的熒光釋放，目的基因擴增，相應熒光強度增加，PCR儀器通過實時熒光探測系統探測不同波長熒光的強度，并隨時報告擴增圖譜，從而對基因分型結果進行識讀。用96孔板體外擴增，每次檢測設4孔為空白對照。

1.2.4 LECs中RNA的提取及cDNA的制備行白內障超聲乳化吸除術時，撕取5mm直徑的晶狀體中央前囊膜(含LECs)，用Trizol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)從晶狀體囊膜中提取總RNA。用Narodrop測定OD260/OD280值(1.7

1.2.5 qRT-PCR法檢測LECs中LSSmRNA表達量選取LSS(assay ID:Hs01552331_m1)，以人GAPDH(Hs02786624_g1)作為內參，加入TaqMan Expression Master Mix(Thermos fisher)，用ABI公司的step-one型實時PCR儀分析，通過檢測熒光信號，比較LSS和內參基因的Ct值，最后用2-ΔΔCt分析相關基因的表達情況。該實驗對每個樣本重復做3次。

統計學分析：采用Stata 17.0和Stata Corp統計軟件程序進行統計分析。使用HaploView4.2軟件進行連鎖不平衡分析。采用獨立樣本t檢驗比較對照組和ARC組的年齡差異；采用卡方檢驗比較其性別差異。采用卡方檢驗分析對照組和ARC組及各型ARC組的等位基因頻率之間的關聯，并計算各基因型的哈迪-溫伯格平衡。當等位基因分析中發現任何陽性結果時，用Bonferroni校正進一步對結果進行校正，以Pa作為Bonferroni校正值。采用單因素方差分析來計算進行qRT-PCR檢測結果的組間比較，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2結果

2.1對照組和ARC組基因SNPs位點基因型分布流調人群對照組和ARC組SNPs等位基因頻率分布LSS基因rs2968位點，對照組稀有等位基因占30.31%，ARC組占26.32%，差異有統計學意義(P=0.018)；但是Bonferroni校正后差異消失(P=0.072)。LSS基因rs9980968位點，對照組稀有等位基因占16.48%，ARC組占14.03%，差異無統計學意義(P>0.05)；MHGCR基因rs12916位點，對照組稀有等位基因占42.80%，ARC組占44.72%，差異無統計學意義(P>0.05)；MHGCR基因rs17238484位點，對照組稀有等位基因占32.81%，ARC組占31.32%，差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 SNPs位點基因型分布

分層分析后發現LSS基因rs2968位點，與核型ARC的等位基因頻率差異有統計學意義(P=0.003)，其中A等位基因為易感基因。Bonferroni校正后差異依然存在(P=0.012)；與皮質型、后囊下型、混合型均無明顯統計學意義(P>0.05)，見表5。

表5 LSS-rs2968與各型ARC之間的關系%

2.2對照組和各型ARC患者LECs中LSS表達差異住院人群ARC組各亞型的LECs中LSS的mRNA表達均低于對照組(P<0.05)，各型ARC組間比較無差異，見圖1。

圖1 對照組及ARC前囊膜樣本中LSS mRNA的表達 各型ARC組晶狀體前囊膜樣本中LSS mRNA比對照組均低。aP<0.05 vs對照組。

3討論

ARC的病因和發病機制至今仍不清楚。研究表明，基因與環境因素之間的相互作用，包括膽固醇代謝、年齡、性別、紫外線、氧化應激等，都與ARC有關[3,10,13,17]。研究發現，膽固醇的上游底物羊毛甾醇可以減少晶狀體的蛋白質聚集，減少白內障的形成[5-6]。羊毛甾醇和25-羥基膽固醇是兩種機制上不同的抗白內障藥物先導化合物[18]。但目前尚未找到合適的溶劑溶解羊毛甾醇[5]。羊毛甾醇的合成是一個復雜的過程，涉及20多個步驟[8-12]，其中最關鍵的限制酶是LSS和HMGCR[9,12]。LSS是羊毛甾醇合成酶，又稱環氧角鯊烯環化酶(oxidosqualene cyclase,OSC)，是在生物界普遍存在的一類酶，參與動植物的多項生理活動，具有調節脂類代謝的生理功能[9,11,19]。HMGCR催化HMGCoA生成甲羥戊酸，是膽固醇合成途徑中關鍵的限速步驟[10,12]。我們推測LSS和HMGCR可能與ARC發生發展相關。

已有研究表明抑制LSS活性可誘導大鼠晶狀體混濁，若同時加入羊毛甾醇能有效地延遲晶狀體混濁的發生[20]。LSS能在晶狀體上皮細胞的變性和凋亡的早期階段起保護作用來預防白內障[9]。研究表明20號染色體上的LSS可能是具有遺傳性白內障特征的大鼠發生白內障的主要致病基因[21]。研究發現，LSS的遺傳變異與慢性腎臟損傷[22]以及神經外胚層綜合征[23]有關。Zhao等[5]在先天性白內障的LSS基因上發現了突變位點(W581R和G588S)，后又有人報道了先天性白內障患者的LSS基因存在突變[24]，證實LSS可能與人類白內障的發生有關，因此我們進一步推測LSS和HMGCR的遺傳變異可能與ARC有關。SNP是人類基因組中最豐富的一種遺傳變異形式，存在于DNA的任何區域，包括內含子、編碼區和非翻譯區[25]。我們也報道了DNA修復基因中的SNPs與ARC相關[13-14]。在本研究中，我們選擇了LSS和HMGCR的4個SNPs，并發現LSS-rs2968與核型ARC相關，其中A等位基因為易感基因。研究表明，LSS在大鼠和人白內障晶狀體中的表達均呈下降趨勢[20-21]。在本研究中，我們發現與對照組相比，所有ARC亞型的LECs中LSS的表達均下降。

綜上所述，我們的結果表明，LSS-rs2968基因可能影響漢族人群核型ARC的易感性。與對照組相比，所有ARC亞型的LSS表達均下降。但我們還沒有解釋LSS-rs2968與ARC的易感性相關以及ARC患者LECs中LSS下降之間的聯系。rs2968位于LSS基因的3’-UTR區，可能該SNP改變了LSS與微小RNA(miRNAs)的結合。在可能的情況下，未來的研究應繼續進行流行病學調查，擴大流行病學人群樣本量，以探索SNPs和ARC之間的關系。另外我們將繼續收集臨床患者樣本并進行基因型檢測，闡明不同基因型的患者之間LECs中是否存在LSS的表達差異，并進一步通過生物信息學分析和其他實驗階段解釋兩者之間的相關機制。