MiR-144-3p在肺腺癌中的機制研究

王江波

(濮陽市人民醫院心胸外科，河南 濮陽 457009)

肺癌仍然是全世界癌癥相關死亡的主要原因[1]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌的80%，其中大多數為肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)。盡管可以通過使用其他技術和新開發的治療方法來提高LUAD的早期診斷[2]，但大多數患者的預后仍然很差。惡性腫瘤最常見的特征是轉移，這是導致患者5年生存率低的主要原因[3]。因此，闡明LUAD的分子機制，探索治療肺腺癌的新靶標具有重要意義。

微小RNA(miRNA)是一類小的非編碼RNA，包括19～25個核苷酸。先前的研究結果表明[4]，成熟的miRNA可通過與3＇非翻譯區(3＇-UTR)結合而抑制靶mRNA的翻譯。miRNA在調節廣泛的細胞過程中發揮關鍵作用，包括增殖、分化、凋亡和轉移[5]。最近的研究已經發現，miRNA的異常表達與許多疾病密切相關，特別是癌癥[6]。此外，在有關人類癌癥的多項研究中，已經揭示了miR-144-3p作為腫瘤抑制因子的作用，例如，Liu等報道miR-144-3p通過靶向下調EZH2抑制LUAD細胞的增殖和侵襲[7]。miR-144還可以通過靶向ZFX抑制肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移[8]。但是，關于miR-144-3p與鈣黏著蛋白2(CDH2)在LUAD的作用機制還不清楚。

在本次研究中，我們系統闡述了LUAD中miR-144-3p和CDH2的作用機制，為LUAD的分子靶向治療提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 生物信息學分析

從TCGA數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載TCGA-LUAD的miRNA表達量數據和臨床數據[n(Normal)=46，n(tumor)=521]，利用edge R進行差異分析(|logFC|>2，padj<0.01)。利用Target Scan數據庫預測miR-144-3p的潛在靶向基因。同時，對TCGA中LUAD的基因表達情況進行差異分析(采用R語言“DESeq2”包，以正常樣本為對照，進行差異分析，以|logFC|>1.5，adj p-value<0.05為差異mRNA篩選標準)，并選擇分析結果中在LUAD中的差異上調基因與預測結果取交集。

1.2 細胞培養

人肺腺癌細胞Calu-3、HCC-827、NCI-H23以及人支氣管上皮細胞HBE均購自美國ATCC公司。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基在37℃、5% CO2環境中孵育培養。

1.3 細胞轉染

取對數生長期的HCC-827細胞2×105個懸于2mL完全培養液中，接種于6孔板內，細胞長至70%匯合時進行細胞轉染。按照脂質體介導轉染方法和LipofectamineTM3000說明書操作，將miR-144-3p-mimic、miR-144-3p-inhibitor及各自的陰性對照NC-mimic、NC-inhibitor轉染至HCC-827細胞中。第二天，大概有70～80%細胞轉染，使用定量qRT-PCR確定轉染是否成功。

CDH2質粒購自GeneCopoeia(Germantown，MD，USA)，并使用Lipofectamine?2 000試劑盒轉染到HCC-827細胞中，孵育48h后，使用定量qRT-PCR或Western blot分析確定轉染是否成功。

1.4 qPCR檢測

按上述分組分別收集2×105個細胞，使用TRIzol試劑(Invitrogen，CA，USA)提取總RNA，并使用生物分光光度計測定其濃度和純度。使用PrimeScript RT試劑盒(TaKaRa，Dalian，China)將RNA反轉錄為cDNA。使用miRNA提取試劑盒(Tiangen，Beijing，China)進行miRNA提取。用SYBRPremix Ex Taq(TaKaRa，Dalian，China)進行qRT-PCR。U6和GAPDH內源性對照的相對表達水平通過2-ΔΔCt方法計算。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.5 Western blot分析實驗

使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液(Beyotime Institute of Biotechnology，Haimen，China)提取總蛋白，并用BCA試劑盒(Beyotime Institute ofBiotechnology，Haimen，China)檢測蛋白質濃度。將總蛋白(50μg)加入SDS-PAGE凝膠加樣孔中，在60V條件下進行電泳，直至溴酚藍從底部流出停止電泳。然后將蛋白質轉移到硝酸纖維素濾膜(NC)上，用脫脂牛奶(5%～10%)在室溫下封閉2h。隨后加入一抗，在4℃孵育過夜。第二天用1×TBST溶液(pH=7.4)洗滌3次，添加辣根過氧化酶標記的二抗山羊抗兔IgG(ab6721，1∶3000，abcam，Cambridge，UK)，雜交120 min后TBST洗膜3次，最后用ECL試劑盒(Solarbio，Beijing，China)進行發光反應，并進行拍照，實驗重復3次。一抗包括：CDH2(ab76011，1∶10000，abcam)，GAPDH(ab9484，1∶2500，abcam)。

1.6 MTT測定

使用3-(4，5-dmethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)方法測定細胞活力。收集細胞并將其接種到96孔板中培養，在不同的時間段(24、48、72和96h)溫育后，將20 μL溶于Hank平衡鹽溶液的MTT四唑鹽添加到每個孔中，終濃度為5μg/mL，并將板在CO2中溫育培養箱中溫育1～4h。最后，從每個孔中吸出培養基，并加入200μL二甲基亞砜以溶解甲瓚(Formazan)晶體。使用微量滴定板分光光度計以及參考波長為450nm獲得每個孔的吸光度。每個實驗重復3遍。

1.7 Transwell入侵檢測

使用8 mm膜孔transwell室進行入侵測定。將無血清培養基中的1×105個細胞接種到上室中，該室預先用Matrigel(BD，Bedford，MA，USA)包被。溫育24h后，將遷移至膜下表面的細胞用100%甲醇固定，并用0.1%結晶紫染色。然后用棉簽除去上膜表面上的非侵襲性細胞。分別對下表面的細胞計數并拍照。

1.8 雙熒光素酶實驗

使用PCR擴增CDH2的3′UTR，并將其克隆到pmirGLO熒光素酶基因下游的多克隆位點中，并根據生物信息學預測的miR-144-3p與CDH2的靶結合位點進行定點突變，使用Lipofectamine 2000轉染24孔板中70%融合的HCC-827細胞。每孔共轉染構建的野生型或突變型pmirGLO載體(100 ng)、5 ng的pRL-SV40 Renilla熒光素酶構建體(用于標準化)和100 ngmiR-144-3p模擬物，miR-144-3p抑制劑或它們各自的NC。轉染后48h制備細胞提取物，并使用雙重熒光素酶報告基因檢測系統(Promega，USA)測量熒光素酶活性。

1.9 統計學方法

使用GraphPad Prism7.0軟件進行統計學分析。所有值均表示為每組至少三個重復的單獨實驗的平均值±標準偏差，兩組之間的比較采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 MiR-144-3p在肺腺癌細胞中下調

首先，在TCGA-LUAD數據集中我們發現miR-144-3p在腫瘤組織中極顯著低表達(圖1A，封二)，且miR-144-3p低表達與肺腺癌患者預后不良顯著相關(圖1B，封二)。接著，我們檢測了miR-144-3p在肺腺癌細胞及相應的正常細胞中的表達。qRT-PCR結果顯示，與正常細胞相比，在肺腺癌細胞中miR-144-3p的表達均明顯減少，其中以HCC-827的下調最為顯著(圖1C，封二)，因此，本文的后續實驗選擇了HCC-827細胞系作為研究對象。

2.2 MiR-144-3p負調控肺腺癌細胞生長、增殖和侵襲

我們使用qRT-PCR檢測miR-144-3p在不同組HCC-827細胞中的表達情況，如圖2A(封二)所示，miR-144-3p抑制劑可以明顯抑制miR-144-3p的表達。MTT結果表明，miR-144-3p過表達的細胞系與其他三組相比，增殖能力顯著下降，相反，抑制miR-144-3p表達，細胞增殖能力明顯增強(圖2B，封二，P<0.05)。此外，為了探究miR-144-3p在肺腺癌細胞侵襲中的作用，我們進行了Transwell侵襲實驗。我們的研究結果(圖2C，封二)表明，miR-144-3p過表達可以抑制細胞侵襲，反之亦然。以上結果表明，miR-144-3p負調控肺腺癌細胞生長、增殖和侵襲。

2.3 CDH2是miR-144-3p的直接靶標

我們利用生物信息學分析預測了miR-144-3p的直接靶標，結果顯示CDH2的3＇-UTR與miR-144-3p結合，他們的結合序列如圖3A(封三)所示。根據預測結果，我們進行了雙重熒光素酶報告基因檢測，以研究CDH2是否是miR-144-3p的直接靶標。在miR-144-3p和CDH2-3＇-UTR共轉染的HCC-827細胞中，熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)。但是，在miR-144-3p和CDH2突變的3＇-UTR共轉染的HCC-827細胞中，熒光素酶活性與對照組相比無明顯差異(圖3B，封三)。由此，我們可以確認miR-144-3p是CDH2的直接靶標。為了進一步證實這些結果，我們分析了CDH2在LUAD組織和細胞中的表達。利用TCGA-LUAD數據集我們發現CDH2在腫瘤組織中顯著高表達(圖3C，封三)。基于此，我們利用qRT-PCR和western blot檢測了CDH2分別在人肺腺癌細胞Calu-3、HCC-827、NCI-H23以及人支氣管上皮細胞HBE中的表達情況。與正常細胞相比，CDH2在肺腺癌細胞中均顯著高表達(圖3D、E，封三)。為了進一步研究miR-144-3p和CDH2在肺腺癌細胞之間的關系，我們檢測了CDH2在不同處理下HCC-827細胞中的表達水平。結果顯示，抑制miR-144-3p表達導致CDH2的表達上調，而過表達miR-144-3p則導致CDH2的表達顯著下調(圖3F，封三)。由此我們可以得出，CDH2是miR-144-3p的直接靶標，且在LUAD細胞中miR-144-3p能夠靶向下調CDH2。

2.4 MiR-144-3p通過靶向下調CDH2抑制肺腺癌細胞的生長、增殖和侵襲

為了研究miR-144-3p和CDH2在肺腺癌中的作用機制，我們進行了一系列實驗。首先，我們用miR-mimics以及miR-mimics+oe-CDH2分別轉染HCC-827細胞，同時，NC-mimic以及NC-mimic+oe-NC轉染的細胞用作對照組。qRT-PCR和Western blot如圖4A(封三)所示，在肺腺癌細胞中，miR-144-3p過表達顯著抑制CDH2的表達，而同時過表達miR-144-3p和CDH2則明顯恢復，進一步說明了CDH2的表達能夠被miR-144-3p下調。在上述轉染的HCC-827細胞中分別進行MTT測定和Transwell侵襲實驗。結果顯示，過表達miR-144-3p后肺腺癌細胞生長、增殖和侵襲的能力明顯下降(見圖4B、C，封三)。由此可以說明miR-144-3p通過靶向下調CDH2抑制肺腺癌細胞的生長、增殖和侵襲。

3 討 論

MiRNA是一類小的非編碼的單鏈RNA分子，通常存在于植物、動物和一些病毒中，并且在RNA沉默和基因表達的轉錄后調控中發揮重要作用[4]。大多數miRNA在基因組中以單拷貝、多拷貝或簇的形式存在，并且大多數具有發夾結構。miRNA通過堿基互補配對(完全配對或不完全配對)靶向mRNA的3＇-UTR，直接降解mRNA或抑制翻譯，從而完成對靶基因的轉錄后調控[9]。近幾年來，越來越多的研究表明miRNA在細胞增殖、轉移、分化等生物學過程中均發揮重要作用。研究發現miR-144-3p失調與多種人類癌癥的進展有關，例如miR-144-3p通過下調ARID1A促進了透明細胞腎細胞癌中的細胞增殖和轉移[10]。此外，miR-144-3p還通過抑制細胞繁殖、侵襲和遷移而在膠質母細胞瘤中起到抑癌作用。已經證實了miR-144在肺癌中明顯下調[11]，這和我們的研究結果一致。Chen等報道，miR-144通過靶向下調TIGAR抑制肺癌細胞的增殖并誘導其凋亡和自噬[12]。但是，文獻中尚未闡明miR-144-3p和CDH2之間的潛在聯系。本次實驗中，我們假設CDH2可能是肺腺癌細胞中miR-144-3p的直接靶基因，結果證實了這一假設。

CDH2編碼一種稱為N-cadherin的蛋白質，是cadherin家族的成員，調節許多生物過程[13]。研究顯示[14]，CDH2通常在各種癌癥中上調，例如，CDH2的過表達促進了耐厄洛替尼肺癌細胞的侵襲并誘導了EMT。研究發現，miR-124通過調節CDH2表達和EMT進程在NSCLC增殖和侵襲中起關鍵作用[15]。此外，有研究報道，miR-194通過靶向下調CDH2抑制骨肉瘤細胞的增殖和遷移[16]。本次研究中，我們發現CDH2在肺腺癌細胞中顯著高表達，并且與miR-144-3p的表達呈負相關。

總而言之，我們的研究證實了miR-144-3p可以通過靶向下調CDH2抑制肺腺癌細胞的生長、增殖和侵襲，這對于探討LUAD的作用機制提供了的新的參考，并且miR-144-3p可以作為LUAD的潛在分子治療靶點。