EGFR以及nm23的蛋白表達在鼻咽癌預后及復發中的意義* *

蘇 菁，肖 騁

(1.咸寧市中心醫院/湖北科技學院附屬第一醫院耳鼻咽喉科，湖北 咸寧 437100；2.咸寧市中心醫院/湖北科技學院附屬第一醫院神經內科)

鼻咽癌(NPC)是中國和東南亞部分省份頭頸部最常見的惡性腫瘤之一[1-2]，原因尚不清楚，目前認為它與遺傳、環境和病毒因素有關[3]。由于鼻咽部隱蔽的解剖位置，從而導致NPC早期癥狀不典型，大多數鼻咽癌患者在診斷明確時已經處于頸淋巴結轉移的中晚期，最終治療效果不佳。研究表明，局部復發和遠處轉移是絕大多數患者死亡的最終原因[4]，因此，找尋具有腫瘤特異性及與臨床預后相關的分子標志物是提高腫瘤早期診斷準確率以及判斷預后的關鍵，并且可能成為新的治療靶標[5-6]。目前，關于鼻咽癌復發和轉移相關分子標志物的研究很少，尋找NPC復發和轉移相關的分子標志物對預測鼻咽癌患者預后和復發具有重要臨床意義。內皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是酪氨酸蛋白激酶受體之一，它是由c-erbB致癌基因編碼的一組受體[7]，EGFR信號通路已被證明在多種腫瘤的發生和發展中起重要作用[8]；nm23是第一個在轉移性癌細胞中低表達的細胞，其表達與各種惡性腫瘤中的腫瘤轉移潛能呈負相關[9-10]。EGFR及nm23這兩種受體在NPC中的表達及與NPC臨床分期和淋巴結轉移，以及遠處轉移的關系有著不同的結論。本研究采用免疫組織化學方法檢測鼻咽癌組織中EGFR和nm23的表達，探討其與鼻咽癌發生、發展的關系，并進一步分析兩者是否可作為評估鼻咽癌侵襲、浸潤和轉移潛能及預后的有效參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧2004年1月至2012年1月本科收治確診為鼻咽癌患者(無抗癌治療)為觀察組；所有納入患者均保留原始的病理組織蠟塊并且有完整的隨訪記錄。該標準內病例共納入55例患者，其中男40例，女15例；平均年齡(43.7±1.6)歲；NPC分期采用1992年福州TNM分期法，其中Ⅰ～Ⅱ期22例，Ⅲ～Ⅳ期33例；頸淋巴結轉移40例，其中N1期18例，N2期15例，N3期7例；無淋巴結轉移15例。Ⅰ、Ⅱ期行放療，放療量:NPDT 6800～7200CGy；除了Ⅲ期和Ⅳ期的放療外，還合并了順鉑(DDP)和氟尿嘧啶(5-FU)聯合化療。對照組20例鼻咽黏膜標本病理報告診斷為鼻咽黏膜慢性炎癥，其中男15例，女5例；平均年齡(42.3±2.1)歲。

1.2 檢測方法

所有組織標本常規石蠟包埋后切片，予以蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色核實病理學診斷。運用二步法免疫組織化學法檢測切片組織中EGFR、nm23的表達。鼠抗人EGFR單克隆抗體及nm23單克隆抗體，免疫組織化學SP試劑盒和二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑均由武漢三鷹生物技術有限公司提供?？乖迯头椒ú捎梦⒉ㄐ迯?0s，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照，采用已知鼻咽癌陽性組織切片作為陽性對照。

1.3 結果評定

分別切取5張不同層面的組織蠟塊切片進行染色，每張切片在鏡下(200倍)隨機選取5個不同視野進行分析。指標EGFR表達采用不透光平均值分析(尼康SP4200分析軟件)，根據觀察范圍內不透光平均值將表達強度分為0～3度不同等級，其中0代表陰性(-)；1代表弱陽性(+)；2代表中度陽性(++)；3則為強陽性(+++)。nm23則采用陽性細胞數人工統計進行判定，由3名實驗員分別閱片，統計視野中陽性細胞數的表達比例，將陽性率分為0～4個等級，分別為0級：≤5%；1級：6%～25%；2級：26%～50%；3級：51%～75%；4級:≥76%，0～4級分別對應陰性(-)、弱陽性(+)、中度陽性(++)、強陽性(+++)、強強陽性(++++)。

1.4 統計學方法

所有數據均采用SPSS 14．0統計學軟件進行統計分析，分別行χ2檢驗及Pearson列聯系數分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組鼻咽黏膜組織中EGFR、nm23蛋白表達比較

在對照組及觀察組的鼻咽黏膜組織中EGFR的陽性表達率分別為5.45%(3/55)及76.36%(42/55)(P<0.01)，而nm23在對照組以及觀察組的鼻咽黏膜組織中陽性表達率分別為74.54%(41/55)及32.72%(18/55)(P<0.01)，提示EGFR在觀察組的鼻咽黏膜組織中表達明顯較高，而nm23則在對照組的鼻咽黏膜組織中表達較高，均具有較好的特異性。具體見圖1(封三)。

2.2 鼻咽癌患者鼻咽黏膜組織中EGFR、nm23表達與臨床特征及預后的關系

如表1所示，鼻咽癌患者的鼻咽黏膜中EGFR的表達水平與臨床分期呈正相關，Ⅲ、Ⅳ期患者癌組織中EGFR表達高于Ⅰ、Ⅱ期(P<0.05)，與腫瘤的遠處轉移率呈正相關(P<0.05)，與5年生存期呈負相關(P<0.05)，但其表達與性別、年齡、淋巴轉移、T分期、N分期以及原位復發率無明顯相關性。而鼻咽癌患者的鼻咽黏膜中nm23的表達水平與臨床分期(P<0.05)、N分期(P<0.05)、遠處轉移(P<0.05)均呈負相關。nm23的表達水平與5年生存率呈正相關(P<0.05)。但nm23表達與性別、年齡、T分期以及原位復發率均無明顯相關性。

表1 EGFR及nm23表達與鼻咽癌臨床特征及預后的關系

2.3 鼻咽癌組織中EGFR、nm23蛋白表達與鼻咽癌患者生存時間的分析

我們采用乘積極限法對55例患者的生存時間進行單因素的生存分析，并制作生存曲線。結果發現(圖2)EGFR蛋白表達(+～+++)組的中位生存時間為44.5個月，而EGFR蛋白表達(-)組的中位生存時間為65個月，2組間差異具有統計學意義(P<0.05)；nm23蛋白表達(+)組的中位生存時間為88個月，nm23蛋白表達(-)組的中位生存時間為44個月，兩組間的差異具有統計學意義(P<0.05)。

A：EGFR(+～+++)對比EGFR(-)；B：nm23(+～+++)對比(-)

3 討 論

由于NPC解剖結構復雜以及對放射線敏感，使得放射性療法成為目前所有無遠處轉移NPC首選的治療方案，即使是在疾病的晚期，單獨使用放療仍可達到高于70%的控制率，且5年生存率可達到50%[11]。對晚期病例，聯合放化療是目前公認最為規范的治療方式[12-13]，研究表明在晚期患者中，放化療結合可提高5年生存率[14]。雖然，隨著治療方式的不斷進展，NPC的5年生存率逐漸提高，但這當中依然有25%～30%的患者最終會發生腫瘤的原位復發或遠處轉移，這仍然是NPC治療中最具有挑戰性的問題[15-16]。在當前的治療水平下，尋找早期的預警生物標志物成為提高治療效果的最佳選擇。

EGFR可與多種配體結合并通過激活下游的通路調控多種生物學過程[17]。研究提示EGFR信號通路的改變在腫瘤血管生成、增殖浸潤以及細胞凋亡的過程中發揮了至關重要的作用[18]。已有研究證實，EGFR的表達水平與頭頸部鱗癌的關系密切，EGFR較高的表達水平則預示著較低的生存率[19]。但NPC在病因學、流行病學、臨床過程、預后結局以及治療選擇等方面與頭頸部鱗癌以及其他腫瘤均有所不同，其具有局部易復發以及好遠處轉移的特點。因此，本研究著重觀察了NPC的臨床特點和EGFR表達兩者之間的關系。研究結果顯示，在NPC患者中EGFR的陽性表達率是明顯較高的，提示EGFR與NPC的發生關系密切，可作為區分良惡性的參考指標。進一步通過對其與NPC臨床特征的關系分析，發現在有遠處轉移的患者中EGFR的表達率較無遠處轉移者高。因為EGFR調控血管的生長以及細胞移行等多種生物學過程，EGFR參與腫瘤的遠處轉移并不讓人驚訝。同時我們還發現在臨床分期Ⅲ-Ⅳ患者較Ⅰ-Ⅱ期患者組織中EGFR表達率明顯升高，及5年以上生存率患者較5年以下生存率患者EGFR表達明顯較低。上述結果表明，EGFR蛋白的高表達表明腫瘤是侵襲性非常強大的，因此，遠處轉移的可能性也很大，其5年生存率相對較低。

nm23基因被認為是抑制腫瘤遠處轉移及其轉移潛能的最重要基因之一。研究證實，nm23低表達或者突變與一系列組織中惡行腫瘤的不良預后有密切關系，如乳腺、胃腸、肝臟以及黑色素瘤等[20]。但目前為止，nm23表達與NPC的預后之間的關系報道甚少。在本研究中發現，與EGFR類似的nm23表達與NPC患者的臨床分期、遠處轉移以及5年生存率密切相關，這可能與nm23的編碼產物二磷酸核苷激酶(NDPK)有關。NDPK調節G蛋白介導的細胞信號傳導，影響微管組裝，維持正常細胞分裂，從而抑制癌細胞轉移[21]。我們同樣認為，nm23的低表達提示鼻咽癌出現遠處轉移的風險較高，預示預后較差，同時nm23表達還與5年生存率密切相關。nm23的高表達提示鼻咽癌的預后較好，生存時間較長。

腫瘤的侵襲與轉移由多種因素影響，比如試驗樣本選擇、評分標準等，而且它是一個多基因、多步驟的復雜過程，因此，EGFR與nm23之間的關聯性還需要我們進一步的研究。這個實驗表明，NPC的生物學行為與EGFR、nm23的異常表達有著非常密切的關系，EGFR的高表達和nm23的低表達反映出鼻咽腫瘤的生物學行為更危險，惡性程度高，患者預后相對較差。因此，我們推測EGFR、nm23可作為判斷鼻咽癌惡性程度和預后的有價值指標。