高氏盆炎方五號方對慢性盆腔炎大鼠抗炎、抗粘連的作用及機制研究※

王楚然 高 慧 徐文君 郝艷紅 陳十昔

(華北理工大學中醫學院2017級碩士研究生，河北 唐山 063000)

慢性盆腔炎(chronic pelvic inflammatory disease，CPID)近年來被稱為盆腔炎性疾病后遺癥(sequelae of pelvic inflammatory disease，SPID)，即急性盆腔炎失治、誤治，或患者身體狀況不佳、免疫系統較弱導致病程延長，但也有部分患者起病緩慢，無急性病史[1]。CPID主要臨床表現為下腹部疼痛，伴有肛門和腰腹墜脹疼痛，白帶增多、質稠、異味等，屬中醫學婦人腹痛、癥瘕、帶下病、不孕等范疇。近年來CPID發病率呈逐漸上升趨勢，其病因復雜，病情纏綿，治療棘手[2-3]。現代醫學主要是抗炎治療，抗生素有一定作用，但患者易產生耐藥性且常有副作用[4]。中醫治療CPID具有療效明顯、無副作用、無耐藥性、給藥方法多樣等優勢[5]，在抗炎、殺菌、調節免疫及鎮痛等方面療效確切[6]。高氏盆炎方系列方由高慧教授總結臨床經驗創立，各號方針對CPID不同證型，其中五號方具有活血化瘀、溫經散寒、破瘀消癥功效，臨床主要用于治療寒凝血瘀型CPID。本實驗通過觀察高氏盆炎方五號方對CPID大鼠抗炎、抗粘連的作用機制，為其臨床治療CPID提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級健康雌性SD大鼠75只，12周齡，體質量200～250 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK(冀)2013-1003。飼養于河北中醫學院實驗中心，室溫23～25 ℃，勤通風，光照條件良好，自由攝食、飲水，墊料每3 d更換1次。

1.1.2 實驗藥物 高氏盆炎方五號方藥物組成：丹參15 g，小茴香6 g，沒藥10 g，炮姜4 g，肉桂10 g，赤芍15 g，延胡索15 g，當歸10 g，桃仁10 g，三棱10 g，蒲黃10 g，莪術10 g，五靈脂10 g。以上中藥購自河北省石家莊市中醫院中藥房，由河北省石家莊市中醫院制劑室將其煎熬濃縮成生藥濃度為2.8 g/mL的中藥溶液，保存在4 ℃冰箱中備用。少腹逐瘀顆粒(吉林敖東延邊藥業股份有限公司，國藥準字Z20000041)，用蒸餾水配制成0.2 g/mL溶液，保存在4 ℃冰箱中備用；人胎盤組織液(湖南一格制藥有限公司,國藥準字S43020001)。

1.1.3 實驗試劑及儀器 磷酸鹽緩沖液(PBS)[生工生物工程(上海)股份有限公司]；戊巴比妥鈉(中國醫藥集團上海化學試劑公司)；苯酚凝膠(河北中醫學院藥理學實驗室)；4%多聚甲醛固定液(上海遠慕生物科技有限公司)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(內含蘇木素染液、分化液、伊紅染液)(北京索萊寶科技有限公司)；人成纖維細胞生長因子2(FGF-2)酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒、白細胞介素2(IL-2)ELISA檢測試劑盒(南京嘉譽達生物科技有限公司)；FGF-2免疫組化試劑盒(上海森雄科技實業有限公司)；一抗工作液、二抗工作液(上海森雄科技實業有限公司)；總RNA試劑盒(美國OMEGA公司)；熒光定量試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；數碼顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)；酶標儀(MK3型，芬蘭雷勃集團中國區總部)；實時熒光定量PCR儀(7500型，美國應用生物系統公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物造模及分組 75只SD雄性大鼠常規飼養7 d適應環境后，于第8 d清晨禁食，隨機抽取10只為空白組，其余65只造模。使用2%戊巴比妥鈉溶液50 mg/kg對大鼠進行腹腔麻醉，待麻醉滿意后，將大鼠仰臥位固定，剪去手術區被毛，碘伏消毒，于大鼠下腹正中做切口，長約1 cm，從膀胱后找到子宮，暴露并固定，首先用注射器針頭機械損傷大鼠左側子宮內膜組織，再用1 mL注射器從子宮分叉處進針，向左側子宮內注入苯酚凝膠配制的25%苯酚膠漿0.06 mL，之后立即夾閉針孔，同時墊高大鼠臀部偏向于右側，防止苯酚膠漿流出，最后將子宮納入腹腔，逐層縫合切口，碘酊消毒術區皮膚，傷口使用敷料覆蓋包扎。造模后第10 d，隨機抽取5只大鼠，開腹取子宮組織，光鏡下見子宮壁增厚，正常組織被破壞，慢性炎癥細胞浸潤，以淋巴細胞為主，表明CPID大鼠模型建立成功。將余下60只大鼠按照隨機數字表法分為6組，即模型組、少腹逐瘀顆粒組、人胎盤組織液組及高氏盆炎方五號方高、中、低劑量組，每組10只。

1.2.2 給藥方法 空白組自由食水；模型組予0.9%氯化鈉注射液1 mL/100 g灌胃；高氏盆炎方五號方高中、低、劑量組分別予高氏盆炎方五號方28、14、7 g/kg灌胃；少腹逐瘀顆粒組予少腹逐瘀顆粒1.5 g/kg灌胃；人胎盤組織液組予人胎盤組織液1 mL/kg后腿大腿肌肉處注射。均每日1次，連續20 d。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 血清FGF-2、IL-2含量 于給藥后第21 d清晨禁食，末次給藥24 h后，予2%戊巴比妥鈉溶液50 mg/kg對大鼠進行腹腔麻醉，麻醉后固定，采集腹主動脈血，靜置，離心，取上清，分裝低溫保存備用，ELASA法測定血清FGF-2、IL-2含量，嚴格按試劑盒說明書操作。

1.3.2 子宮組織病理形態學 取大鼠子宮組織，分離多余脂肪，使用4%多聚甲醛固定液固定。脫水處理后，二甲苯透明，2次浸蠟，常規石蠟包埋，將每個子宮組織切成石蠟切片，然后做烘干處理，經HE染色，樹脂封片，數碼顯微鏡下(×200倍)觀察子宮組織病理形態學變化。

1.3.3 FGF-2蛋白表達水平 大鼠子宮組織石蠟切片常規脫蠟至水化；恒溫培育；熱修復抗原90 s，PBS沖洗，每次3 min，重復3次；置于3%過氧化氫(H2O2)，37 ℃孵育10～15 min，PBS沖洗，每次3 min，重復3次；非免疫血清封閉40 min；滴加適當比例稀釋過的一抗工作液過夜，PBS沖洗，每次3 min，重復3次；滴加二抗工作液，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗，每次3 min，重復3次；滴加PBS，37 ℃孵育10～15 min，PBS沖洗，每次3 min，重復3次；用二氨基聯苯胺(DAB)顯色后常規脫水；透明；中性樹膠封片。圖像采集時，在特定的放大倍數下，盡量選擇相同部位視野。鏡下可見子宮細胞內出現棕黃色顆粒時為陽性表達。用HMIAS-2000高清晰度彩色醫學圖文分析系統細胞測量程序計算單位面積陽性細胞表達的平均光密度值(AOD)，AOD越大陽性細胞表達越強。

1.3.4 FGF-2 mRNA表達水平 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)法測定FGF-2 mRNA表達水平。取出凍存的子宮組織，粉碎、搖勻，取細胞懸液加入總RNA提取試劑1 mL常規方法提取總RNA，取5 μL RNA樣品測定濃度后，逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，按照熒光定量試劑盒說明書建立反應體系20 μL(包括cDNA模板1 μL，2×PCR PreMix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，50×TOX ReferenceDye 0.4 μL，去核糖核酸酶(RNase)的水6.6 μL)，反應參數設置如下：預變性95 ℃ 10 min，然后(95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s)×40個循環反應。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參，用實時熒光定量PCR儀對cDNA擴增，獲得qRT-PCR反應曲線，FGF-2基因Ct值-GAPDH基因Ct值=ΔCt，計算每個目的基因的Q值及Q均值(按照公式Q=2-ΔCt)，最后求出RQ值(RQ=Q值/Q均值)，將RQ值統計分析。擴增的目的基因引物序列和片段長度見表1。

表1 擴增的目的基因引物序列和片段長度

2 結果

2.1 各組大鼠子宮組織病理形態學變化 光鏡下空白組大鼠子宮各層界限清楚，腺體規整，未見炎癥細胞浸潤。模型組大鼠宮腔擴張處子宮壁變薄，增生明顯處子宮壁增厚，腺體被破壞，有內膜上皮脫失現象，部分成纖維細胞增生，全層皆可見大量炎癥細胞浸潤。高氏盆炎方五號方高劑量組大鼠宮腔擴張程度明顯輕于模型組，上皮細胞形態趨于正常，內膜基本無充血水腫，炎癥細胞明顯減少。高氏盆炎方五號方中劑量組大鼠宮腔擴張程度明顯輕于模型組，子宮腔壁結構正常或稍增厚，大部分腺體恢復正常，稍有內膜充血、水腫，成纖維細胞增生不明顯，少量炎癥細胞浸潤。高氏盆炎方五號方低劑量組大鼠宮腔擴張程度輕于模型組，肌層結構較紊亂，部分內膜充血、水腫，上皮細胞形態可見增生樣變，較多炎癥細胞浸潤。少腹逐瘀顆粒組大鼠子宮組織病理形態學變化與高氏盆炎方五號方低劑量組相似。人胎盤組織液組大鼠宮腔擴張程度明顯輕于模型組，子宮組織結構稍清晰，上皮細胞增生現象減少，間質細胞輕度水腫，腺體較完整，少量炎癥細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠子宮組織病理形態學(HE，×200)

2.2 各組大鼠血清FGF-2、IL-2含量比較 見表2。

由表2可見，模型組FGF-2含量高于空白組(P<0.05)，IL-2含量低于空白組(P<0.05)；高氏盆炎方五號方高、中、低劑量組及少腹逐瘀顆粒組、人胎盤組織液組FGF-2含量均低于模型組(P<0.05)，IL-2含量均高于模型組(P<0.05)；高氏盆炎方五號方高、中劑量組FGF-2含量均低于少腹逐瘀顆粒組(P<0.05)，IL-2含量均高于少腹逐瘀顆粒組(P<0.05)；高氏盆炎方五號方低劑量組、少腹逐瘀顆粒組FGF-2含量均高于人胎盤組織液組(P<0.05)，IL-2含量低于人胎盤組織液組(P<0.05)；高氏盆炎方五號方高、中劑量組FGF-2含量均低于高氏盆炎方五號方低劑量組(P<0.05)，IL-2含量均高于高氏盆炎方五號方低劑量組(P<0.05)；空白組、高氏盆炎方五號方高、中劑量組及人胎盤組織液組FGF-2、IL-2含量兩兩比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠血清FGF-2、IL-2含量比較

2.3 各組大鼠子宮組織FGF-2蛋白表達的AOD比較 見表3。

表3 各組大鼠子宮組織FGF-2蛋白表達的AOD比較

由表3可見，模型組FGF-2蛋白表達的AOD高于空白組(P<0.05)；高氏盆炎方五號方高、中、低劑量組及少腹逐瘀顆粒組、人胎盤組織液組FGF-2蛋白表達的AOD均低于模型組(P<0.05)；高氏盆炎方五號方高、中劑量組FGF-2蛋白表達的AOD均低于少腹逐瘀顆粒組(P<0.05)；高氏盆炎方五號方低劑量組、少腹逐瘀顆粒組FGF-2蛋白表達的AOD均高于人胎盤組織液組(P<0.05)；高氏盆炎方五號方高、中劑量組FGF-2蛋白表達的AOD均低于高氏盆炎方五號方低劑量組(P<0.05)；空白組、高氏盆炎方五號方高、中劑量組及人胎盤組織液組FGF-2蛋白表達的AOD兩兩比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠子宮組織FGF-2蛋白表達(免疫組化，×400)

2.4 各組大鼠子宮組織FGF-2 mRNA表達水平比較 見表4。

由表4可見，模型組FGF-2 mRNA表達水平高于空白組(P<0.05)；高氏盆炎方五號方高、中、低劑量組及少腹逐瘀顆粒組、人胎盤組織液組FGF-2 mRNA表達水平均低于模型組(P<0.05)；高氏盆炎方五號方高、中劑量組FGF-2 mRNA表達水平均低于少腹逐瘀顆粒組(P<0.05)；高氏盆炎方五號方低劑量組、少腹逐瘀顆粒組FGF-2 mRNA表達水平均高于人胎盤組織液組(P<0.05)；高氏盆炎方五號方高、中劑量組FGF-2 mRNA表達水平均低于高氏盆炎方五號方低劑量組(P<0.05)；空白組、高氏盆炎方五號方高、中劑量組及人胎盤組織液組FGF-2 mRNA表達水平兩兩比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

表4 各組大鼠子宮組織FGF-2 mRNA表達水平比較

3 討論

CPID是婦科常見病和多發病，也是引起盆腔粘連的最常見原因之一[7]，其反復發作、經久不愈的特點嚴重影響婦女身心健康，增加家庭和社會負擔[8]。CPID臨床癥狀多以下腹刺痛或墜痛為主，經期、性生活后及勞累后加重，月經色黯有塊，舌質黯有瘀斑，脈澀等血瘀證癥狀。高教授根據多年臨床經驗認為，血瘀是CPID的核心病機，寒凝血瘀證是常見證型。高氏盆炎方五號方將少腹逐瘀湯、宮外孕Ⅱ號方(丹參、赤芍、桃仁、三棱、莪術)兩方化裁合用，在溫陽化瘀基礎上增強破瘀消癥作用，形成以活血化瘀消癥為主，兼溫經止痛的治療大法。方中赤芍、蒲黃、五靈脂、丹參、桃仁、三棱、莪術、沒藥活血祛瘀消癥為主，小茴香、炮姜、延胡索、當歸、肉桂溫經理氣止痛為主，諸藥合用，攻補兼施，行氣破血，調達氣機，消癥散結，活血化瘀，消腫止痛，溫經散寒，扶正祛邪，為婦科治療CPID的有效方劑。現代醫學研究發現，具有活血化瘀作用的藥物能改善微循環，增強細胞免疫及體液免疫作用，使纖維蛋白溶解酶活性增強，粘連松解，從而達到治療CPID目的[9-10]。

高教授提出盆腔炎有濕性炎癥和干性炎癥不同，急性盆腔炎多是以滲出為主的“濕性炎癥”，CPID多是以增生、粘連為主的“干性炎癥”，故CPID所致盆腔粘連是亟待解決的問題。FGF-2過度表達可促進炎癥組織中成纖維細胞的過度增殖與分化，合成大量膠原纖維，是與CPID密切相關的粘連相關細胞因子。研究發現，CPID模型大鼠子宮組織中若發生炎癥和粘連可表現為FGF-2表達增高[11]。FGF-2也是加快血管生成的因子，修復血管同時會使子宮組織的纖維化與粘連更加嚴重，同時它也發揮了促炎作用，誘導炎癥因子和自由基產生，加重炎性反應[11-12]。IL-2參與炎性反應和免疫反應，是機體重要的抗炎生化標志物，激發免疫效應器細胞，參與抗體反應，起到明顯的抗炎作用，還可調節免疫功能，增強人體自身的抗感染能力[13-14]。

本實驗結果顯示，模型組大鼠血清FGF-2水平和子宮組織FGF-2蛋白及FGF-2 mRNA表達水平明顯升高，血清IL-2水平明顯降低，與空白組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，提示FGF-2過度表達，促進炎癥組織中成纖維細胞的過度增殖與分化，抗炎因子IL-2表達被抑制，加重炎性反應。經治療，高氏盆炎方五號方高、中、低劑量組血清FGF-2水平和子宮組織FGF-2蛋白及FGF-2 mRNA表達水平降低，血清IL-2水平升高，與模型組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，高氏盆炎方五號方高、中劑量組與空白組、人胎盤組織液組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，說明高氏盆炎方五號方可有效降低FGF-2在CPID大鼠血清和子宮組織中水平，升高血清中IL-2含量，從而減輕大鼠子宮組織的纖維化和瘢痕，防止和減少粘連，提高自身抗炎能力，并可減輕慢性炎癥的嚴重程度。其中高氏盆炎方五號方高、中劑量組等效，治療效果最突出，高氏盆炎方五號方低劑量組療效次之，可能是劑量不足所致。

綜上所述，高氏盆炎方五號方對CPID大鼠可起到抑制炎癥發展、促進炎癥吸收及抗組織粘連作用，其機制可能與下調FGF-2水平、上調IL-2水平有關。