響應面法優化亞臨界萃取冰島刺參內臟油脂工藝

徐夢豪 梁 艷 姚艷艷 朱紀海 趙祥忠

(1. 齊魯工業大學〔山東省科學院〕食品科學與工程學院，山東 濟南 250353；2. 威海長青海洋科技股份有限公司，山東 威海 264300；3. 山東中碩海洋科技有限公司，山東 日照 276800)

冰島刺參(Cucumariafrondosa)，屬棘皮動物門(Echinodermata)海參綱(Holothuroidea)枝手目(Dendrochirota)瓜參科(Cucumariidae)[1]，主要分布于冰島、加拿大、俄羅斯、挪威等北大西洋海域。其富含蛋白質[2]、維生素、多糖[3-4]、三萜糖苷[5]和脂類等多種活性成分，具有抗癌[6]、抗血栓[7]、抗炎[8]、抗高血糖[9]、免疫調節[10]等功能。參腸及其性腺組織是冰島刺參內臟中的主要器官，被統稱為海參花[11]，其食用歷史悠久[12]，是珍貴的水產制品之一。冰島刺參內臟中脂類物質豐富，包含糖脂、磷脂、胡蘿卜素、脂溶性維生素以及脂肪酸等脂溶性成分。多不飽和脂肪酸(PUFA)約占內臟中脂類物質的44%，且以EPA為主[13-15]。冰島刺參在初級加工過程中會留有大量內臟，小部分被制作成干品海參花，但大部分作為飼料進行處理，造成了資源浪費。

亞臨界流體萃取技術是一種在飽和壓力下，亞臨界狀態的萃取溶劑與物料在系統內相接觸，并經浸提、蒸發脫溶、壓縮、冷凝回收等過程，從天然產物中萃取目標組分的一種分離技術，已被廣泛應用于各類天然產物的萃取與分離[16]，而采用亞臨界萃取技術萃取冰島刺參內臟油脂的工藝尚未見報道。試驗擬根據Box-Behnken中心組合試驗原理分析方法，優化并建立一種萃取冰島刺參內臟油脂的新工藝，并與不同萃取方法的油脂進行理化指標與GC-MS分析比較，為開發全新冰島刺參衍生產品以及提高冰島刺參內臟附加值提供依據。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

冰島刺參內臟(含性腺、參腸、胃囊)：榮成石島集團有限公司；

正己烷：色譜級，天津科密歐化學試劑有限公司；

甲醇：色譜級，上海星可高純溶劑有限公司；

硫酸：分析純，煙臺遠東精細化工有限公司。

1.2 儀器與設備

真空冷凍干燥試驗機：LG0.2型，新陽速凍設備制造有限公司；

亞臨界流體萃取實驗室成套設備：CBE-30+5L型，河南省亞臨界生物技術有限公司；

色譜柱：TR-FAME型，100 m×0.25 mm×0.20 μm，美國賽默飛公司；

電子天平：HZT-A2000型，福州華志科學儀器有限公司；

高速中藥粉碎機：HX-200型，浙江省永康市溪岸五金藥具廠；

氣相色譜—質譜聯用儀：Aglient 7890B GC-5977B MSD型，美國安捷倫公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗流程及操作要點

冰島刺參內臟清洗→控水→稱量→凍干→稱量→粉碎過篩→裝袋→萃取→GC/MS分析

(1) 樣品前處理：將冰島刺參內臟洗凈后進行凍干。冷阱溫度-35 ℃，真空度10 Pa，冷凍干燥時間48 h，粉碎過40目篩，陰涼干燥處保存備用。

(2) 萃取條件：按單因素及響應面優化后萃取參數進行。

(3) 油脂甲酯化：根據文獻[17]修改如下：取1 mL油脂樣品于具塞試管中，加入5 mL 5%硫酸—甲醇溶液，75 ℃水浴甲酯化2 h，冷卻，加入2.5 mL正己烷充分振蕩，靜置分層，取上層清液于玻璃試管中，加入適量無水硫酸鈉干燥，收集干燥樣品，上機檢測。按式(1)計算萃取率。

(1)

式中：

ω——油脂萃取率，%；

M1——油脂質量，g；

M2——樣品質量，g。

1.3.2 油脂理化指標測定

(1) 皂化值：根據GB/T 5534—1995。

(2) 過氧化值：根據GB 5009.227—2016。

(3) 碘值：根據GB/T 5532—2008。

(4) 水分及揮發物：根據GB 5009.236—2016。

1.3.3 氣相色譜—質譜分析條件 根據廉桂芳[17]的方法并修改。色譜條件：進樣量1 μL；載氣為氦氣，流速1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：60 ℃保持2 min，以30 ℃/min升溫至120 ℃，再以2 ℃/min升溫至250 ℃，保持2 min。質譜條件：EI離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，接口溫度250 ℃，質量掃描范圍50～550 amu。

1.3.4 定性分析 樣品經GC-MS檢測后，利用其所配置的NIST 14標準質譜數據庫對樣品進行自動檢索。

1.3.5 定量分析 按照峰面積歸一化法計算各方法所得海參內臟油脂中EPA的相對含量。

1.4 響應面法優化亞臨界萃取內臟油脂工藝

1.4.1 單因素試驗

(1) 料液比：固定萃取壓強0.2 MPa，萃取次數3次，萃取時間30 min，萃取溫度40 ℃，考察料液比(m冰島刺參∶V萃取液)[1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5 (g/mL)]對亞臨界萃取冰島刺參油脂萃取率的影響。

(2) 萃取壓強：固定料液比(m冰島刺參∶V萃取液)1∶2 (g/mL)，萃取次數3次，萃取時間30 min，萃取溫度40 ℃，考察萃取壓強(0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 MPa)對亞臨界萃取冰島刺參油脂萃取率的影響。

(3) 萃取次數：固定料液比(m冰島刺參∶V萃取液)1∶2 (g/mL)，萃取壓強0.2 MPa，萃取時間30 min，萃取溫度40 ℃，考察萃取次數(1，2，3，4，5)對亞臨界萃取冰島刺參油脂萃取率的影響。

(4) 萃取時間：固定料液比(m冰島刺參∶V萃取液)1∶2 (g/mL)，萃取壓強0.2 MPa，萃取次數3次，萃取溫度40 ℃，考察萃取時間(20，30，40，50，60 min)對亞臨界萃取冰島刺參油脂萃取率的影響。

(5) 萃取溫度：固定料液比(m冰島刺參∶V萃取液)1∶2 (g/mL)，萃取壓強0.2 MPa，萃取次數3次，萃取時間30 min，考察萃取溫度(30，35，40，45，50，55，60 ℃)對亞臨界萃取冰島刺參油脂萃取率的影響。

1.4.2 響應面設計 在單因素試驗基礎上，選取萃取次數、萃取時間、萃取溫度3個因素，利用Design-Expert 10.0 根據Box-Behnken中心組合原理進行三因素三水平響應面設計，以油脂萃取率為評價指標，優化亞臨界萃取冰島刺參內臟油脂的工藝條件。

1.4.3 數據處理 所有試驗平行3次，取平均值，采用Origin 8.0軟件進行線性回歸分析及作圖，采用Design-Expert 10.0軟件進行響應曲面分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對油脂萃取率的影響 由圖1可知，隨著料液比的逐漸增加，內臟油脂的萃取率先升高后略微下降，當料液比(m冰島刺參∶V萃取液)為1∶3 (g/mL)時，萃取效果達到最佳，此時萃取率為17.77%。萃取過程中，高濃度的溶質分子會更容易溶出于低濃度的溶劑中，隨著溶劑的增大，溶質分子與溶劑會逐漸達到固液溶解平衡。當繼續增加溶劑，溶質分子無法通過固液界面進入溶劑相，萃取率下降。同時，過多的萃取溶劑會使溶劑回收過程中損失部分油脂，還會產生溶劑殘留過量的問題。

圖1 料液比對冰島刺參內臟油脂萃取率的影響

2.1.2 萃取壓強對油脂萃取率的影響 由圖2可知，當萃取壓強為0.2～0.4 MPa時，油脂萃取率隨萃取壓強的增加而增大，當萃取壓強為0.4 MPa時，油脂萃取率最大為18.77%。萃取壓強過高會影響物料中部分油脂的溶解性，同時會使部分溶質分子結構發生改變，變為氣態小分子，無法進入液態萃取溶劑。因此整體萃取系統的萃取壓強選擇0.4 MPa最佳。

2.1.3 萃取次數對油脂萃取率的影響 由圖3可知，隨著萃取次數的增加，冰島刺參內臟油脂萃取率不斷升高，當萃取次數達3次后，繼續增加萃取次數，萃取率變化不顯著。其中萃取5次比萃取3次的萃取率僅增加了0.4%，而萃取3次比萃取1次的萃取率增加了8.05%。綜合考慮，選取萃取次數為3次較佳。

2.1.4 萃取時間對油脂萃取率的影響 由圖4可知，當萃取時間為20～40 min時，萃取時間的延長會顯著影響內臟油脂的萃取率，且萃取40 min時的萃取率達17.4%。當萃取時間>40 min時，內臟油脂的萃取率變化較小，萃取時間增加至60 min時，油脂的萃取率僅增加了0.9%。因此，萃取時間選擇40 min適宜。

圖2 萃取壓強對冰島刺參內臟油脂萃取率的影響

圖3 萃取次數對冰島刺參內臟油脂萃取率的影響

圖4 萃取時間對冰島刺參內臟油脂萃取率的影響

2.1.5 萃取溫度對油脂萃取率的影響 由圖5可知，當萃取溫度為30～45 ℃時，隨著萃取溫度的升高，油脂萃取率逐漸升高，當萃取溫度為45 ℃時，油脂萃取率達最高值17.9%。綜上，亞臨界萃取冰島刺參內臟油脂的溫度應控制在45 ℃左右。

圖5 萃取溫度對冰島刺參內臟油脂萃取率的影響

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗設計與結果 在單因素試驗基礎上，以油脂萃取率為評價指標，以萃取次數、萃取時間、料液比為考察因素，根據Box-Behnken中心組合原理進行三因素三水平響應面試驗，試驗因素水平編碼見表1，試驗方案與結果見表2。

利用Design-Expert 10.0軟件對表2進行回歸分析，得回歸方程：

R=21.04+1.38A+1.06B+1.27C+0.97AB+0.83AC-0.018BC-0.92A2-0.89B2-0.90C2。

(2)

表1 響應面試驗因素與水平編碼表

表2 響應面試驗方案與結果

2.2.3 各因素間的交互作用 由圖6～圖8可知，萃取次數與萃取時間交互作用最為顯著，其次是萃取次數與萃取溫度；萃取時間與萃取溫度交互作用的響應面趨于平緩，等高線圖顯示接近于圓，故二者交互作用并不顯著，與響應面方差分析結果一致。

2.2.4 萃取工藝條件確定及驗證 分析響應面法試驗數據可知，冰島刺參內臟油脂模型的極值點A=0.967，B=0.618，C=0.710。經計算可得最優萃取條件為萃取次數5次、萃取時間56.18 min、萃取溫度48.55 ℃、最大萃取率23.41%。對最優條件進行實驗驗證得萃取率為23.38%，與預測值的相對誤差為0.03%，說明響應面法能較好地對冰島刺參內臟油脂的萃取工藝進行回歸分析和優化。

2.3 不同萃取方法油脂的理化指標

由表4可知，亞臨界法萃取的冰島刺參內臟油脂過氧化值低于其他兩種方法，說明亞臨界工藝的低溫萃取對油脂起到了很好的保護作用；同時所萃取出的油脂水分及揮發物少，說明亞臨界法的萃取專一性高，有利于油脂的后續加工。綜合皂化值及碘值數據，說明亞臨界法萃取冰島刺參內臟油脂具有較大的優勢。

2.4 不同萃取方法油脂的GC-MS分析

由圖9可知，亞臨界法萃取的油脂中EPA(47.568 min 出峰)相對含量達40.7%，溶劑法萃取的油脂中EPA(47.506 min出峰)相對含量為33.3%，酶解法萃取的油脂中EPA(47.755 min出峰)相對含量為39.6%，與其他兩種方法相比，亞臨界萃取法萃取的油脂的雜質少，且不飽和脂肪酸EPA含量最高。

表3 回歸模型的方差分析?

圖6 萃取次數與萃取時間的交互作用對冰島刺參內臟油脂萃取率的影響

圖7 萃取次數與萃取溫度的交互作用對冰島刺參內臟油脂萃取率的影響

圖8 萃取時間與萃取溫度的交互作用對冰島刺參內臟油脂萃取率的影響

表4 不同萃取方法的油脂理化指標

3 結論

以富含脂類活性物質的凍干冰島刺參內臟(含性腺、海參腸、胃囊)為原料，利用亞臨界工藝進行油脂萃取。結果表明，最佳亞臨界萃取工藝條件為料液比(m冰島刺參∶V萃取液)1∶3 (g/mL)、萃取壓強0.4 MPa、萃取次數5次、萃取時間56.18 min、萃取溫度48.55 ℃。此工藝條件下的油脂萃取率為23.38%。通過對比不同萃取方法的油脂的理化指標及氣相色譜圖，發現亞臨界法萃取的油脂中的氧化程度低，EPA相對含量達40.7%，說明亞臨界法萃取冰島刺參內臟油脂的工藝效率高，油脂品質更穩定。后續擬開展冰島刺參內臟油脂成分全面分析，并進行分離純化。

圖9 不同萃取方法油脂的GC-MS圖譜