蛇葡萄素對結腸癌細胞增殖抑制、自噬誘導及自噬對增殖的影響研究

李晨紅， 宋長豐， 林志康， 趙宇俠，2*

（1.上海中醫藥大學 研究生院，上海200120； 2.上海健康醫學院 醫學技術學院，上海201138；3.華東理工大學 藥學院，上海200237）

結腸癌是胃腸外科常見的消化道惡性腫瘤，在我國的發病率和死亡率均排在前五，且呈逐年上升趨勢［1-2］，包括結腸癌在內的腫瘤是一種細胞凋亡過少而增殖過多的疾病，若能抑制腫瘤細胞的增殖并誘導其凋亡，腫瘤細胞就有可能停止生長［3］，從而控制腫瘤的發生發展，因此有效抑制癌細胞增殖和促進凋亡是治療的關鍵，尋找合適的靶點來調控腫瘤成為抗腫瘤藥物關注的熱點問題.

最近研究證實自噬與多種腫瘤細胞的惡性轉化和生長相關［4］.隨著研究的不斷深入，發現自噬相關分子例如Beclin1與腫瘤的發展有著密不可分的關系［5］，一定程度的細胞自噬可以抑制腫瘤的增殖及轉移［6-7］，同時，自噬過程被證明能夠通過調控腫瘤細胞凋亡及細胞增殖過程等形式抑制腫瘤［8-10］.關于自噬蛋白作為抗腫瘤靶點的研究也已經進入臨床前研究［11-12］，探討自噬與腫瘤細胞增殖關系具有積極的臨床應用意義.

中藥抗腫瘤作用的深入研究成為中藥現代化推進的一項主要內容，AMP作為被廣泛報道有抗腫瘤作用的中藥單體，對于其抗腫瘤機制的研究也有大量報道，包括誘導細胞凋亡、抑制腫瘤侵襲轉移、抑制細胞增殖［13-16］等.而且，AMP也被報道可以誘導細胞自噬［13-15］，那么AMP是否能夠通過自噬作用實現對細胞增殖過程的調控進而起到促進腫瘤細胞增殖抑制的作用值得研究，這將為自噬靶點的臨床應用提供可行依據.

目前關于AMP誘導結腸癌HCT116細胞自噬且自噬對結腸癌細胞增殖的影響報道較少，本研究通過慢病毒感染法構建HCT116-RFP-GFP-LC3重組細胞株，體外實驗將不同濃度AMP作用于HCT116及重組細胞株，初步探索AMP對結腸癌細胞的增殖活力、自噬誘導作用及阻斷自噬晚期降解過程對結腸癌細胞增殖的影響，為深入研究其抗腫瘤機制提供一定依據，以期為結腸癌的治療提供新思路.

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人結腸癌HCT116細胞來源于中國科學院細胞庫；自噬慢病毒由上海吉凱基因化學技術有限公司構建，感染所用感染試劑（Polybrene，Enhanced Infection Solution）均由其提供.RPMI 1640培養基，質量分數1%青鏈霉素購自上海生工生物工程有限公司；胎牛血清、胰酶購自美國Gibco公司；嘌呤霉素（puromycin），巴佛洛霉素（Baf A1），質量分數4%多聚甲醛均購自北京建強偉業科技有限公司；蛇葡萄素（Ampelopsin，AMP）購自曼斯特生物科技有限公司；預染蛋白Marker購自美國Thermo公司；CCK-8檢測試劑盒，Bradford蛋白定量試劑盒，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗人β-actin、LC3B、P62抗體，山羊抗兔抗體均為美國Proteintech Group產品；ECL超敏發光液購自美國Bio-Rad公司；其他試劑均為國產分析純級別試劑.

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 使用RPMI 1640培養基（含質量分數10%FBS+質量分數1%青鏈霉素）于37℃、體積分數5%CO2培養箱中培養，根據細胞密度進行傳代.

1.2.2 慢病毒感染 將HCT116細胞按5×103個/mL接種于96孔板中，細胞密度約30%開始感染，操作嚴格按照吉凱基因公司提供的說明書進行，以感染復數（MOI）為20設置實驗分組，按照不同感染條件將實驗分為4組：正常培養基組、含質量濃度5μg/mL Polybrene的正常培養基組、Enhanced Infection Solution組和含質量濃度5μg/mL Polybrene的Enhanced Infection Solution組.感染72 h后激光共聚焦顯微鏡觀察細胞熒光蛋白表達情況，選取MOI為20、含質量濃度5μg/mL Polybrene的Enhanced Infection Solution條件擴大培養，每2～3 d換含puromycin（終質量濃度3μg/mL）的完全培養液一次，至不感染篩選對照組細胞被puromycin殺光，將感染并篩選后的細胞進行傳代，并繼續施加puromycin進行維持性篩選培養，連續篩選并傳3代后，凍存保種穩定細胞株.

1.2.3 激光共聚焦觀察結腸癌細胞熒光表達 將HCT116-RFP-GFP-LC3重組細胞按5×105個/mL接種于6孔板爬片中，待細胞貼壁后棄培養基，用PBS洗2次，加入適量質量分數4%多聚甲醛溶液固定10 min，PBS洗3次，封片劑封片，通過激光共聚焦顯微鏡在200×下觀察并記錄綠紅色熒光表達，確認構建重組細胞株成功.

將重組細胞按5×104個/mL接種于24孔板中，分別用AMP（質量濃度0、50、75μg/mL）組及AMP（質量濃度0、50、75μg/mL）+Baf A1組處理24 h，檢測AMP誘導HCT116-RFP-GFP-LC3重組細胞自噬情況.棄培養基，PBS洗2次，用1 mL DAPI溶液覆蓋細胞染色15 min，PBS洗3次，加入適量質量分數4%多聚甲醛溶液固定10 min，PBS洗2次，封片劑封片，通過激光共聚焦顯微鏡（630×）隨機觀察3個視野并記錄，LC3自噬點的計算方法參照Popp等［17］研究方法，采用Image J軟件中“Threshold”和“Analyze Particles”功能進行圖像分析.

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖活力 將HCT116細胞按1×104個/mL接種于96孔板中，用AMP（質量濃度0、25、50、75、150、300μg/mL）處理24 h，每孔加質量分數10%CCK-8溶液反應1 h.酶標儀檢測每孔在450 nm處的吸光度（OD值），計算

設置3個重復實驗測定AMP對HCT116細胞增殖影響.

1.2.5 細胞形態學觀察 將HCT116細胞按5×105個/mL接種于6孔板中，用AMP（質量濃度0、25、50、75、150、300μg/mL）處理24 h，用PBS洗2次，質量分數4%多聚甲醛固定5 min，PBS洗2次，倒置顯微鏡（100×）下觀察并記錄細胞形態學變化.

1.2.6 蛋白質印跡法檢測自噬相關蛋白表達 將HCT116細胞按5×105個/mL接種于6孔板中，AMP（質量濃度0、50、75μg/mL）組及AMP（質量濃度0、50、75μg/mL）+Baf A1組處理24 h，用預冷的PBS（含質量分數5%PMSF）洗滌3次后，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4℃12 000 g條件下離心取上清，采用Bradford法定量蛋白濃度.隨后取40μg蛋白進行質量分數15%SDS-PAGE電泳，250 mA、0.5 h條件下PVDF膜轉膜1 h，質量分數5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入一抗兔抗人的β-actin、LC3B、P62抗體（稀釋比例為1∶1 000）后4℃孵育過夜；次日TBST液洗膜后加入山羊抗兔的二抗（稀釋比例為1∶2 000），室溫孵育2 h，充分洗膜后ECL發光液避光孵育1 min顯影，用Image Lab軟件分析每組目的蛋白和相對應的內參蛋白條帶灰度值.

1.2.7 統計學方法 所有研究結果均采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計量資料呈正態分布，以均數±標準差±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD法，P＜0.05表示差異有統計學意義.

2 結果

2.1 穩定表達RFP-GFP-LC3蛋白的細胞系鑒定結果 HCT116-RFP-GFP-LC3重組細胞由攜帶有LC3、RFP、GFP全基因的重組慢病毒感染，其中RFP、GFP和LC3作為一個重組基因組同步共表達，熒光檢測捕捉到的RFP或GFP熒光蛋白表達則標志為LC3表達，反之亦然；載體結構中包含嘌呤霉素（puromycin）抗性，采用puromycin（3μg/mL）持續篩選細胞，得到感染效率100%的HCT116-RFP-GFP-LC3重組細胞株.激光共聚焦顯微鏡下觀察經感染和嘌呤霉素篩選獲得穩定表達RFP-GFP-LC3蛋白的重組細胞，可以看到RFP或GFP熒光蛋白表達的陽性細胞，且細胞狀態較好（圖1，其中（a）為白光下重組細胞；（b）為紅色熒光LC3蛋白細胞；（c）為綠色熒光LC3蛋白細胞；（d）為（b）和（c）的熒光蛋白細胞merge圖），可以作為檢測細胞自噬標志性蛋白LC3表達的細胞模型.

圖1 重組細胞的RFP-GFP-LC3熒光蛋白表達情況Fig.1 RFP-GFP-LC3 fluorescent protein in recombinant cells

2.2 AMP對HCT116細胞毒性作用 CCK-8法檢測結果（圖2（A）為AMP對HCT116細胞增殖影響）顯示，不同濃度的AMP（質量濃度為0、25、50、75、150、300μg/mL）作用于HCT116細胞24 h后，在低質量濃度（0～75μg/mL）范圍內對HCT116細胞增殖抑制不顯著（P＞0.05）.形態學上觀察無明顯差異（圖2（B）為AMP對HCT116細胞形態影響，其中a、b、c、d、e、f分別指代AMP質量濃度為0、25、50、75、150、300μg/mL處理后HCT116細胞形態圖），但高質量濃度AMP（150、300μg/mL）抑制HCT116細胞增殖活力，細胞形態發生變化，表明AMP具有抗腫瘤作用.

圖2 AMP對HCT116細胞毒性的影響Fig.2 The effect of AMP on the cytotoxicity of HCT116 cells

2.3 AMP誘導結腸癌細胞自噬的結果

2.3.1 激光共聚焦法觀察自噬體形成情況 在本實驗中，選用AMP（質量濃度0、50、75μg/mL）組及AMP（質量濃度為0、50、75μg/mL）+Baf A1組作用HCT116-RFP-GFP-LC3細胞24 h后，激光共聚焦顯微鏡結果如圖3所示，其中圖3（a）為各組細胞自噬發生情況，圖3（b）為各組自噬熒光蛋白表達統計圖，Baf A1為自噬晚期抑制劑，正常對照組的綠色或紅色熒光在細胞中呈散在分布，自噬水平較低，自噬發生率5.15%，AMP（質量濃度50、75 μg/mL）處理組的細胞出現綠色或紅色熒光點狀聚集的自噬體，自噬發生率分別為26.72%、19.47%，說明AMP能夠誘導HCT116-RFP-GFP-LC3細胞發生自噬.

圖3 激光共聚焦檢測AMP-AMP＋Baf A1處理組的HCT116-RFP-GFP-LC3細胞自噬點Fig.3 The fluorescent spot of recombinant cells in the AMP-AMP＋Baf A1 groups were observed by laser confocal microscopy（X630）

一般把自噬過程分成3個階段.第一階段：自噬誘導信號刺激細胞，細胞質中形成杯狀具雙層膜結構的自噬前體；第二階段：自噬前體在一些自噬蛋白的作用下不斷延伸，如伴隨此過程的LC3不斷被聚集到自噬前體上，對自噬前體的延伸起著關鍵的調節作用，進而包裹一些胞漿成分形成自噬泡；第三階段：自噬泡通過胞內運輸系統到達溶酶體，溶酶體、自噬體兩者融合，并在溶酶體的水解酶作用下降解包裹物［18-20］.

實驗中HCT116-RFP-GFP-LC3重組細胞中紅綠色熒光均能代表LC3蛋白的表達，區別在于自噬后期，自噬后期溶酶體與自噬體融合形成自噬溶酶體，環境pH值發生改變，而綠色熒光蛋白對酸性環境敏感.當環境pH＜5時，綠色熒光發生淬滅，不能用來表征LC3表達，只能檢測到紅色熒光點狀聚集，因此綠色熒光只能用來檢測自噬前兩個階段.第三階段溶酶體降解過程，綠色熒光猝滅，紅色熒光可以持續表達表征LC3表達，紅綠熒光共定位復合為黃色熒光，綠色熒光的淬滅證明自噬晚期降解過程完成，紅綠色同時存在則說明自噬處于前兩階段或晚期溶酶體降解過程阻斷，自噬過程沒有完成［4，18，20］.

自噬晚期抑制劑Baf A1通過抑制H+-ATP酶，從而阻止自噬體和溶酶體融合，LC3Ⅱ蛋白就會聚集在自噬體膜上不被降解，綠色熒光蛋白不發生淬滅，紅綠色熒光均能被檢測到，此時能觀察到更多細胞的LC3Ⅱ蛋白熒光自噬點，因此，自噬熒光亮點的細胞數增加表明自噬晚期降解過程被阻斷.換言之，加入Baf A1后，若觀察到自噬點增加證明了自噬晚期降解過程被成功阻斷，而不是自噬誘導增強.本研究中，相對于control組，control+Baf A1組綠色熒光較暗，紅色熒光較多，此時綠光淬滅，紅光正常表達，表明自噬過程完整；同時，相對于AMP（質量濃度0、50、75μg/mL）組，AMP（質量濃度0、50、75μg/mL）+Baf A1組的自噬發生率分別為13.78%、34.69%、40.10%，紅色或綠色點狀聚集的細胞數量分別增多了168%、30%、106%，說明Baf A1有效阻斷AMP誘導的結腸癌細胞自噬晚期降解過程.

2.3.2 蛋白質印跡法檢測自噬相關蛋白表達結果通過蛋白質印跡法對AMP（質量濃度0、50、75μg/mL）及AMP（質量濃度0、50、75μg/mL）+Baf A1組進行了驗證，結果如圖4所示，其中圖4（a）為自噬相關蛋白印跡圖，圖4（b）為對應自噬蛋白表達量統計圖.相對于空白對照組，AMP（質量濃度50、75μg/mL）組細胞的LC3II蛋白表達水平上調，AMP（質量濃度50μg/mL）組變化不顯著（P＞0.05），表明AMP誘導結腸癌HCT116細胞自噬，同時AMP（質量濃度50μg/mL）組的P62蛋白被降解，表明自噬流晚期自噬溶酶體降解過程完成.

加入Baf A1后，自噬晚期降解過程阻斷，相對于AMP（質量濃度0、50、75μg/mL）組，AMP+Baf A1組的LC3II蛋白表達上調，其中AMP（質量濃度0、75μg/mL）+Baf A1組雖然LC3II蛋白表達數值上調，但變化不顯著（P＞0.05）；相對于AMP組，AMP+Baf A1組的P62蛋白表達數值上調，其中AMP（質量濃度0、50μg/mL）+Baf A1組數值增大但不顯著，表明Baf A1加入后阻斷溶酶體降解過程，從而LC3II和P62蛋白未被降解表達上調，側面證明AMP誘導HCT116細胞發生自噬流.

圖4 AMP-AMP＋Baf A1組誘導的HCT116細胞自噬相關蛋白LC3I/II和P62的表達量Fig.4 The expression of the autophagy-related proteins of LC3I/II and P62 in the AMP-AMP＋Baf A1 groups

2.4 阻斷自噬晚期降解過程對HCT116細胞增殖的影響 根據CCK-8實驗結果，選取有顯著性差異的細胞增殖抑制濃度AMP（質量濃度0、75、150、300μg/mL），加入Baf A1后，自噬晚期降解過程阻斷，AMP與AMP+Baf A1組間細胞增殖活力影響不顯著（P＞0.05）（圖5），結果表明AMP（質量濃度0～300μg/mL）范圍內，自噬晚期溶酶體降解過程阻斷對細胞增殖活力無影響.

圖5 Baf A1對AMP誘導的HCT116細胞增殖活力影響Fig.5 The effect of Baf A1 on AMP-induced proliferation in HCT116 cells

3 討論

細胞增殖是生物體的重要生命特征，細胞以分裂的方式進行增殖，增殖是生物體生長、發育、繁殖和遺傳的基礎［21］.腫瘤是一種細胞周期疾病，腫瘤的發生發展與細胞生長周期的失調直接相關，諸多研究表明通過藥物干預抑制腫瘤細胞的周期進程可以抑制腫瘤細胞增殖［22］.本研究中，AMP（0～300μg/mL）作用于結腸癌HCT116細胞24 h后，高濃度下細胞增殖活力受到抑制，細胞形態變化，但低濃度范圍內對HCT116細胞增殖影響不大，細胞形態影響較小，說明AMP具有潛在抗腫瘤的臨床應用價值，這與AMP能夠抑制肺癌、卵巢癌和胃癌的增殖，還能增強奧沙利鉑抗結腸癌的活性［16］報道相一致.

大量報道表明，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Rapamycin Target of Rapamycin，mTOR）是細胞增殖和自噬的中心調節器，因此自噬可能參與并影響細胞增殖過程［23-24］，成為調控細胞增殖的靶點.研究表明，AMP能夠誘導乳腺癌細胞［14］和人膠質瘤細胞［15］自噬，也有報道稱褪黑素通過自噬增強神經干細胞增殖［25］，雙氫青蒿素通過誘導細胞自噬抑制HepG 2.2.15細胞增殖［26］.本研究通過AMP對細胞自噬的誘導以及自噬晚期降解過程阻斷檢測細胞增殖，來探索AMP抑制HCT116細胞增殖的作用是否通過自噬作用調控和實現.

細胞自噬是真核生物中進化保守的對細胞內物質進行周轉的重要過程，利用溶酶體吞噬并降解自身受損蛋白或細胞器并得以循環利用［4，18］.本論文通過構建RFP-GFP-LC3雙熒光自噬指示細胞系作為檢測細胞自噬標志性蛋白LC3表達的細胞模型，選取AMP（質量濃度0、50、75μg/mL）作用于重組株24 h后，激光共聚焦觀察正常對照組細胞中綠色或紅色熒光呈散在分布，自噬發生率為5.15%，AMP（質量濃度50、75μg/mL）組的細胞出現綠色或紅色熒光點狀聚集的自噬體，自噬發生率分別為26.72%、19.47%，說明AMP能夠誘導HCT116-RFP-GFP-LC3細胞發生自噬，這與中藥雷公藤甲素誘導結腸癌細胞自噬的研究相一致［27］.自噬體與溶酶體融合時，與膜表面偶聯的LC3Ⅱ熒光蛋白被降解，自噬熒光顆粒減弱或細胞自噬數目減少，而這個過程被Baf A1阻斷，因此LC3Ⅱ蛋白進入溶酶體后，就會聚集在自噬體膜上不被降解，此時觀察到更多細胞的LC3Ⅱ蛋白熒光自噬顆粒點或更多數量的細胞自噬.實驗中，相對于AMP（質量濃度0、50、75μg/mL）組，AMP+Baf A1組的自噬發生率分別為13.78%、34.69%、40.10%，紅色或綠色點狀聚集的細胞數量分別增多了168%、30%、106%，說明Baf A1能夠有效阻斷AMP誘導的結腸癌細胞的自噬溶酶體降解過程，側面證明發生自噬流過程.

LC3是自噬活性標志物，可直觀反應自噬表達水平，目前最為廣泛的檢測方法是通過蛋白質印跡法檢測LC3蛋白表達水平，SQSTM1/P62是選擇性自噬最重要的貨車蛋白，也被稱為選擇性自噬受體，它是連接LC3與待降解泛素化底物的橋梁，通常選擇P62結合LC3蛋白翻轉實驗評價自噬流［19-20］.蛋白質印跡法對AMP（質量濃度0、50、75μg/mL）組及AMP+Baf A1組進行了驗證，其LC3蛋白表達結果與自噬點檢測的LC3熒光表達觀察結果一致，對應自噬誘導和自噬降解過程阻斷的P62的低表達與未降解蓄積的高表達相呼應，這與AMP能夠促進頭頸部鱗狀細胞癌（HNSSC）自噬的結果一致［13］，以上結果均能證實AMP誘導細胞自噬.

本論文在探索自噬對細胞增殖影響中，采用自噬抑制劑Baf A1人工干預，在AMP（質量濃度0～300μg/mL）劑量范圍內，加入Baf A1，自噬晚期溶酶體降解階段阻斷，圖5結果顯示阻斷自噬晚期降解過程對AMP組與AMP+Baf A1組間細胞增殖活力影響不顯著（P＞0.05），這說明阻斷自噬降解過程對結腸癌HCT116細胞增殖無影響.

目前討論AMP誘導的結腸癌HCT116細胞自噬影響增殖的研究還很少，本研究證實AMP可抑制細胞增殖，發揮抗腫瘤作用，誘導結腸癌HCT116細胞發生自噬，Baf A1阻斷AMP（質量濃度0～300μg/mL）誘導的自噬晚期降解過程，且圖5結果證明阻斷自噬晚期降解過程不影響細胞增殖（P＞0.05），但自噬參與機體多種途徑，是否影響凋亡或抑制細胞周期蛋白D1（CyclinD1）表達等調控抗腫瘤作用還需進一步實驗探索，以期為臨床治療結腸癌提供有效的實驗依據與理論基礎，并揭示了細胞自噬是調控結腸癌治療的潛在靶點.

致謝 上海健康醫學院種子基金（E1-0200-19-201132）和上海健康醫學院百人庫項目（B1-0200-19-311133）對本文給予了資助，謹致謝意.