冬春季層疊式蛋雞舍乳頭式飲水系統細菌含量檢測及其對生產性能的影響

萬 意 季志遠 馬瑞鈺 杜 強 楊榮斌 詹 凱*

(1.安徽省農業科學院 畜牧獸醫研究所/畜禽產品安全工程安徽省重點實驗室，合肥 230001； 2.安徽農業大學 動物科技學院，合肥 230001； 3.安徽圣迪樂村生態食品有限公司，安徽 銅陵 244100)

在現代化商品蛋雞飼養過程中，飲水衛生安全逐漸得到生產者的重視。雞群采食和飲水的同時各種有益和有害物質會被帶入體內，從而對其健康產生危害[1-2]。隨著密閉式乳頭飲水器的普遍使用，部分養殖場通常在水線下方安裝V型接水槽，以防止乳頭故障漏水和雞群飲水外撒滴落至糞帶[3]。然而大多數生產者在關注水線水細菌微生物污染的同時，卻忽略了V接水型槽的衛生情況及其對雞群健康的威脅[4]。

不良的采食和飲水環境會導致畜禽免疫系統任務加重，增重速度減慢，無法提高經濟效益，甚至引發家禽疾病，造成重大的經濟損失[5]。水線下方敞開式的V型槽，由于長期暴露于養殖環境微生物氣溶膠中，加上飲水器滴漏的水和雞采食殘渣以及空氣粉塵，在適宜的環境條件下有害細菌會不斷繁殖[6]，如大腸桿菌、沙門氏菌和葡萄球菌等，若不能及時和有效的控制，日積月累便會造成嚴重的槽內污染。通過對籠內雞群采食習性的觀察發現，雞在采食后喜歡啄飲V型槽內水，這可能會對機體健康有著嚴重影響。因此，飲水系統中V型槽的配備對蛋雞生產性能和企業效益產生的影響有待進一步研究。

為此，本課題組前期在夏季對雞舍內水線水和V型槽水細菌數進行檢測，發現V型槽內污染程度較高且對雞群的產蛋性能和蛋品質有較大負面影響[7]。為了更系統地探究規模化蛋雞場內飲水系統的日常環境衛生，本研究擬以8層層疊式密閉籠養蛋雞舍為研究對象，在冬季和春季測定了雞舍內不同籠層飲水裝置中細菌微生物含量，比較水線水和V型槽水的污染情況及其對蛋雞生產性能的影響，旨在為雞舍內部環境控制和乳頭式飲水系統的完善提供指導依據。

1 材料與方法

1.1 試驗雞舍

選擇安徽圣迪樂村生態食品有限公司的8層層疊式籠養密閉蛋雞舍為對象，單棟存欄羅曼粉殼商品蛋雞5 萬只。雞舍中間用鋼網管理走道隔為上、下樓各4層，長73.0 m，寬16.0 m，吊頂高6.3 m，4列 5走道，單列單層籠位數量為135個，每籠飼養6只雞，履帶式清糞，自動喂料、飲水、環控和集蛋。

1.2 試驗動物與分組

在雞群382日齡時，選擇舍內東邊相鄰2列雞籠的前端(靠近濕簾端，第13號籠)、中端(第73號籠)、后端(靠近風機端，第133號)，每端的第1、3、5和7層，共計24個監測點(監測點示意圖見萬意等[7])。試驗期內若有雞只死亡，則選用體重相近的雞只代替。

1.3 水樣采集和環境參數測定

冬季分別在2019-12-24，2020-01-07和01-21，春季分別在2020-03-31和04-14，于每天上午9:00進行水樣采集和環境參數測定。

采集各監測點對應雞籠內水線水和V型槽水以測定細菌基因總拷貝數，水線水用無菌離心管直接接取50 mL；V型槽中積水用2 mL膠頭滴管吸取，V型槽內無水時使用滅菌棉拭子刮取，一同加入離心管后加DEPC水稀釋至50 mL。所有采樣材料均提前1天高壓滅菌。

同時記錄各監測點環境溫度和濕度，并采用自然沉降法測定空氣細菌數：在籠外放置營養瓊脂糖培養基，于空氣中暴露5 min后蓋上皿蓋并編號，然后將平皿于37 ℃恒溫箱中培養24 h，按奧氏公式[8]計算菌落總數：

C=50 000N/AT

式中：C為每立方米菌落總數，cfu/m3；N為每皿菌落數，個；A為培養皿面積，cm2；T為采樣時間，min。

1.4 水樣細菌基因總拷貝數測定

1.4.1引物設計

熒光定量PCR檢測引物使用細菌16S rDNA通用引物，擴增區域為V3～V4區，序列如下：V3-F：CCT ACG GGN GGC WGC AG，V4-R：GGA CTA CHV GGG TAT CTA AT，擴增產物長度466 bp。

1.4.2樣本總DNA提取

采集后的水樣先進行預處理：使用真空泵抽吸，濾過孔徑0.22 μm的濾膜，待檢細菌截留在濾膜上，以2 mL滅菌水充分涮洗濾膜；洗脫液12 000 rpm離心 10 min，收集沉淀；然后使用通用型基因組DNA提取試劑盒(Magnetic universal genomic DNA kit，DP705，天根生化科技有限公司)進行DNA提取，獲得的基因組DNA以超微量核酸蛋白測定儀檢測濃度及純度(Nanodrop 2000，Thermo Fisher Scientific USA)。

1.4.3標準品質粒制備

絕對定量檢測標準品質粒構建：以大腸桿菌標準株(E.coliATCC 25922)16S rRNA序列為參考序列，將其16S rRNA第332～797位共466 bp的序列構建至T載體pMD -18T中，重組質粒標記為pMD -18T-16S rDNA，長度3 158 bp。提取重組質粒并調整濃度至100 ng/μL，算得其質粒拷貝數為2.89×1010copies/μL。用ddH2O將標準品質粒進行10倍比稀釋，使其濃度為2.89×109～2.89×103copies/μL，獲得7個濃度梯度的標準品模板，用于熒光定量PCR檢測建立標準曲線。

1.4.4qRT-PCR反應體系及步驟

采用SYBR Green I法實時熒光定量PCR進行細菌16S rDNA總拷貝數絕對定量檢測；熒光定量PCR試劑盒為TB Green?Premix Ex TaqTMII (RR820，Takara Japan)。熒光定量PCR反應體系如下：2×TB Green Premix Ex Taq II 10 μL，V3-F 0.5 μL，V4-R 0.5 μL，DNA 1 μL，ddH2O 8 μL，總體積為20 μL。擴增條件：預變性95 ℃ 30 s；擴增循環95 ℃變性5 s，61 ℃退火延伸60 s，進行40個循環。熔解曲線條件如下：98 ℃ 1 s，68 ℃ 60 s，98 ℃ 1 s；其中從68～98 ℃機器持續性采集熒光信號(5 readings/℃)，熔解曲線生成溫度區間。

1.5 生長性能和蛋品質測定

各監測點以3個相鄰籠位雞群為1組，每天上午8:00記錄各組產蛋率、雞蛋質量和畸形蛋率。每2周1次測定各組蛋品質性狀：雞蛋質量、蛋殼強度、蛋殼厚度、蛋殼顏色、蛋黃顏色、蛋白高度和哈氏單位。

1.6 數據處理

試驗數據采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，使用Turkey法進行多重比較，不同籠層的試驗結果為前、中和后三端測定的平均值，結果以“平均數±標準差”表示；各指標間相關系數使用Pearson法進行相關性分析；P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。每1 mL樣本水中細菌基因總拷貝數以10為底取對數表示。

2 結果與分析

2.1 不同籠層的溫度、濕度和空氣細菌數

不同時間測定第1、3、5和7層的溫度、濕度和空氣細菌數見表1。各籠層溫、濕度和空氣細菌數存在差異。由平均值來看，冬季和春季時舍內溫度從第1層至第7層均呈現逐漸升高趨勢，相對濕度呈降低趨勢；冬季和春季時第3和7籠層空氣細菌數均高于第1和5籠層，但差異不顯著(P>0.05)。

2.2 不同籠層水線水和V型槽水細菌基因總拷貝數

不同時間測定第1、3、5和7層水線水和V型槽水中細菌含量見表2。由平均值來看，水線水和V型槽水中細菌基因總拷貝數從2019年冬季至2020年春季隨著時間推移逐漸增多，分別增漲194.98 倍(4.76～7.05個單位)和4.08倍(9.26～9.87個單位)；不同階段水線水中細菌基因總拷貝數在各籠層間差異不大，在冬季時第5層平均值最大，第3層最小，在春季時第7層平均值最大，第1層最小；不同階段V型槽水中細菌基因總拷貝數在各籠層間差異較大，在冬季和春季第3和7層的平均值均高于第1和5層。比較水線水和V型槽水中細菌含量，發現在各階段V型槽水中細菌數均遠高于水線水中(P<0.01)，高達575.44～32 130.51倍，在冬季時差異更明顯。

表1 冬春季雞舍內不同籠層溫濕度和空氣細菌數Table 1 Temperature， humidity and air bacterial count in different tiers of layer house during winter and spring

2.3 不同籠層蛋雞生產性能和蛋品質性狀

舍內不同籠層產蛋率、畸形蛋率及蛋品質性狀分別見表3、表4和表5。從生產性能看，冬季和春季時第1和5層產蛋率均高于第3和7層；冬季和春季時不同籠層畸形蛋率無顯著差異；隨著蛋雞日齡增加，次年春季產蛋率低于冬季，畸形蛋率高于冬季。從蛋品質性狀看，冬季時第5層蛋白高度顯著高于其余各層(P<0.01)，且第1和5層蛋白高度和哈氏單位均高于第3和7層，其余各性狀指標在不同籠層間無顯著差異；春季時第1和5層蛋黃顏色和蛋白高度顯著高于其余各層(P<0.01)，第1和5層哈氏單位均高于第3和7層，其余各性狀指標在不同籠層間無顯著差異。

表3 雞舍內不同籠層產蛋率和畸形蛋率

2.4 細菌基因總拷貝數與環境參數的相關性

水線水和V型槽水中細菌基因總拷貝數與環境參數的相關性見表6。水線水細菌數和V型槽水細菌數在冬季和春季均呈弱正相關(相關系數r=0.223，r=0.225)，環境溫度與濕度在冬季和春季均呈極顯著負相關(r=-0.597，r=-0.921)；水線水細菌數在冬季和春季時，與溫度、濕度和空氣細菌數均呈不同程度弱相關；V型槽細菌數在冬季和春季時，與溫度、濕度和空氣細菌數均呈弱正相關，其中在冬季時與濕度呈顯著正相關(r=0.325)；溫度和濕度與空氣細菌數在冬季和春季時均呈弱相關。

2.5 細菌基因總拷貝數和環境參數與產蛋率和蛋品質的相關性

水線水和V型槽水細菌基因總拷貝數、溫度、濕度和空氣細菌數與產蛋率和蛋品質性狀的相關性見表7。水線水細菌數與產蛋率和蛋品質性狀在冬、春季均呈不同程度弱負相關；V型槽水細菌數與產蛋率和蛋品質性狀在冬季和春季均呈不同程度負相關，其中春季時與蛋白高和哈氏單位呈顯著負相關(r=-0.348，r=-0.479)；空氣細菌數與產蛋率和蛋品質性狀在冬、春季均呈不同程度弱負相關；環境溫度與產蛋率和蛋重在冬、春季均呈不同程度正相關，與蛋白高度和哈氏單位均呈不同程度弱負相關，其中冬季時與產蛋率呈顯著正相關(r=0.215)；環境濕度與產蛋率和蛋品質性狀在冬季和春季均呈不同程度弱相關。

3 討 論

本課題組前期利用16S rDNA 細菌通用引物擴增，通過實時熒光定量PCR法成功檢測了夏季雞舍內水線水和V型槽水中細菌含量，發現不同階段所測V 型槽水細菌基因總拷貝數顯著高于水線水中[7]。本試驗中，冬、春季各階段所測V型槽水細菌基因總拷貝數量在各籠層均遠遠高于水線水中，最高可達32 130.51倍，這與夏季所測情況基本一致。水線水中細菌含量遠低于V型槽中，可能是由于水管密閉僅有飲水乳頭露置在外，加上雞群日常頻繁啄飲有沖洗作用，同時舍內水線水也會提前消毒和定期沖洗，而敞開的V型槽內積水和內容物從未被清洗處理過，日積月累污染嚴重。次年春季水線水和V型槽水中細菌基因總拷貝數均高于冬季，表明隨著時間推移和溫度回升，水線和V型槽內細菌微生物會不斷滋生增加。

舍內溫濕度是影響蛋雞飲食衛生和生產性能的重要因素[9]。李俊營等[10]對6層層疊式籠養密閉式雞舍冬季環境參數進行測定，發現上層平均溫度顯著高于下層，平均濕度顯著低于下層，這與本研究結果一致。舍內環境中微生物形成的氣溶膠不僅污染環境，還可能危害畜禽的健康[11]。魏磊等[12]發現季節變化對舍內氣溶膠的變化會產生一定的影響，冬季氣載金黃色葡萄球菌濃度高于夏季和秋季；牛晉國等[13]測定了雞舍內不同位置細菌氣溶膠濃度，發現細菌氣溶膠濃度與采樣位置無關，但從濕簾端到風機端有升高的趨勢。本試驗中舍內第3和7層空氣細菌數在冬、春季均高于第1和5層，這可能與第3和7層分別處于舍內2個樓層的上部，空氣流動速度較大和濕度較低有關。

表6 水線水和V型槽水細菌基因總拷貝數與溫濕度和空氣細菌數相關分析Table 6 Correlation analysis of 16S rDNA copy number of bacteria in pipe water and V-trough between temperature and humidity as well as bacterial content in air

盧元鵬等[14]發現在4層層疊式籠養蛋雞舍內第1層產蛋率最低，第3層產蛋率最高。Sahin[15]發現不同籠層蛋白指數、蛋黃指數和哈氏單位等均無顯著差異。本試驗中，在冬、春季節舍內第1和5層產蛋率、蛋白高度、哈氏單位均高于第3和7層，除了與各籠層間溫度、濕度和通風量等環境差異有關[16]，還可能與第1和5層V型槽水細菌基因總拷貝數和空氣細菌含量較低有關。推測蛋雞產蛋率和蛋品質與空氣質量和V型槽內微生物環境有關，氣溶膠中細菌可能會對雞呼吸道產生危害，槽內污物等有機物中含有大量的病原微生物，雞群采食后會可能會致腸道和輸卵管慢性疾病的發生。因此，在生產中控制好舍內水線衛生和空氣質量的同時，還需要提高對V型槽內污染情況的關注。

表7 水線水和V型槽水中細菌基因總拷貝數與產蛋率和蛋品質的相關性Table 7 Correlation analysis of 16S rDNA copy number of bacteria in pipe water and V-trough between laying rate and egg quality traits

本研究中，舍內溫度和濕度在不同季節均呈顯著負相關，這與李俊營等[10]研究結果一致。水線水細菌數和V型槽水細菌數在冬、春季節均呈弱正相關，與萬意等[7]夏季的研究結果一致，因為當雞啄飲乳頭時會造成飲水器漏水或外灑至V型槽內，所以水線中微生物滋生也會增加V型槽中的細菌數量。水線水細菌基因總拷貝數與溫、濕度及空氣細菌數呈弱相關，可能是由于水線管密閉且飲水乳頭經常被雞群啄飲，從而溫、濕度及空氣質量對水線水影響較小。V型槽水細菌基因總拷貝數與溫、濕度和空氣細菌數均呈正相關，且在冬季時與濕度呈顯著正相關，表明適宜的溫度和較高的濕度可致使槽內細菌微生物迅速繁殖[17]。因此，控制好合理的舍內溫濕度不僅有利于雞群的生長健康，還可以抑制V型槽內有害微生物的滋生。

溫度與產蛋率、蛋重均呈正相關，其中在冬季與產蛋率呈顯著正相關，提醒在冬季生產中更應重視舍內保暖措施。水線水細菌基因總拷貝數和空氣細菌數與產蛋率和蛋品質性狀等均呈弱相關，表明水線水污染和空氣質量對雞群生產性能影響相對較小；V型槽水細菌基因總拷貝數與產蛋率和蛋品質性狀均呈負相關，其中在春季與蛋白高度和哈氏單位呈顯著負相關，表明V型槽內細菌微生物污染有致使蛋雞生產性能和雞蛋品質下降的趨勢，舍內雞群長期啄飲V型槽水可能會危害機體健康和生產性能，對企業經濟效益產生負面影響。結合前期夏季的研究結果，建議雞舍內飲水系統配備有V型槽的養殖場，無論在夏季還是冬春季都應增強對V型槽衛生安全的關注，需定期采集槽內水樣進行污染情況監測，同時依照自身條件制定并執行一套實用的V型槽清潔消毒技術規程。

4 結 論

1)冬季和春季層疊式蛋雞舍內V 型槽水中細菌微生物含量遠高于水線水中，污染程度更大，次年春季時水線水和V型槽水中細菌微生物含量均高于冬季時。

2)冬季和春季舍內水線水細菌數與V型槽水細菌數均呈弱正相關，V型槽水細菌數與溫度、濕度和空氣細菌數間正相關程度更高，更易受環境質量影響。

3)水線水和V型槽水細菌含量與產蛋率、蛋重、蛋白高度和哈氏單位均呈不同程度負相關，V型槽水細菌污染對蛋雞生產性能和蛋品質有更大的潛在負面影響。