一株西藏牦牛源多殺性巴氏桿菌基因分型及rpoE基因生物信息學分析

周賽賽 李天嬌 武 琦 朱家平 羅 宗 呂 然 趙曉慧 王一飛 羅潤波 貢 嘎 王保寧,2 索朗斯珠*

(1.西藏農牧學院 動物科學學院，西藏 林芝 860000； 2.四川大學 華西基礎醫學與法醫學院，成都 610041)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)歸屬巴氏桿菌目、巴氏桿菌科、巴氏桿菌屬，革蘭陰性兩極濃染、無芽孢的兼性厭氧短小桿菌，因巴斯德在1880年首次從家禽霍亂爆發病例中分離而得名[1-2]。多殺性巴氏桿菌不僅引起多種畜禽發病[3-8]，也是人多種疾病的病原體[9-11]。多殺性巴氏桿菌不僅影響我國的多種動物[12-16]，亞洲、歐洲、非洲的多個國家均有報道[17-23]。近些年，莢膜A型和B型多殺性巴氏桿菌一直影響著我國牛產業體系的發展，且病死率高，有區域流行性。

近些年本課題組通過對西藏地區牦牛源多殺性巴氏桿菌流行病學調查發現，牦牛Pm感染率較高，嚴重影響了我國牦牛產業的發展[4,13]。目前國內尚無專用于防控牦牛多殺性巴氏桿菌的商品化疫苗，商品化牛源多殺性巴氏桿菌疫苗主要以滅活苗為主，臨床試驗發現因不了解牦牛源多殺性巴氏桿菌基因型，盲目用商品化牛源多殺性巴氏桿菌滅活疫苗免疫西藏牦牛，導致不能有效的防控該病，所以了解西藏地區牦牛源多殺性巴氏桿菌的基因型是選擇和制備疫苗的前提，也將有利于防控西藏牦牛出血性敗血癥。Carter[24]于1952年根據細菌莢膜抗原性、特異性，利用血凝試驗將多殺性巴氏桿菌進行了A、B、D和E莢膜分型；Rimler等[25]于1987年從火雞中分離出了多殺性巴氏桿菌，隨后根據Carter的分型方法鑒定出其莢膜F型。Harper等[26]基于脂多糖外核編碼基因簇建立了多重PCR方法，將Pm分為L1～L8基因型，8種基因型和傳統Heddleston等[27]血清分型間有一定的對應關系，但比傳統Heddleston血清分型方法有較高的精確度。Maiden等[28]于1998年利用PCR擴增了多個管家基因內部片段(約7個管家基因)，建立了多位點序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)方法，該方法已經被用于細菌、真菌的分型研究中。目前利用MLST分型鑒定多殺性巴氏桿菌，ST型已有142種，因多殺性巴氏桿菌基因型眾多，若不能了解西藏地區牦牛源多殺性巴氏桿菌的基因型，將嚴重影響該地區的疫病防控。

rpoE是一種控制基因轉錄和翻譯的 σ 因子，基因編碼的RpoE蛋白是 σ 70蛋白家族成員，在維持細菌內環境穩定、毒力、非致死性環境脅迫的過程中有調節作用[29-31]。王林柏[32]已經驗證rpoE為兔巴氏桿菌的一種毒力因子，是良好的減毒疫苗候選蛋白。據報道rpoEσ 因子在沙門氏菌[33]、溶藻性弧菌[34]、大腸桿菌[35]和放線桿菌[36]等細菌中具有調節生物膜合成和適應外界應激能力的重要作用。雖有A型多殺性巴氏桿菌關于RpoE蛋白在免疫保護效力方面的研究[37]，但缺少對多殺性巴氏桿菌rpoE基因的生物信息學分析，西藏牦牛源多殺性巴氏桿菌rpoE基因的研究更是空白。

本研究通過分子學方法對本實驗室分離保存的一株西藏牦牛源多殺性巴氏桿菌進行莢膜分型、脂多糖分型、多位點序列分型鑒定，利用生物信息學方法對rpoE基因及其編碼蛋白進行理化性質、親水和疏水性、跨膜結構域、基因信號肽、亞細胞定位預測、蛋白保守結構域、潛在氨基酸磷酸化位點、二級結構和三級結構、B細胞線性抗原表位、蛋白互作分析，旨在了解西藏牦牛源Pm的基因型，為后期疫苗研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 菌株及質粒

本株牦牛源B型Pm、DH5α 感受態細胞由本實驗室分離、冷凍保存；pMD -TM18T購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 試劑及儀器

PCR擴增的所有引物(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；細菌全基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；Premix TaqTM(Code No.RR901A)、Agarose gel DNA extraction kit(Code No.9762)和Plasmid purification kit(Code No.9760)均購自大連寶生物工程有限公司；微量分光光度計(Thermo NanoDrop 2000，美國)；凝膠成像儀(Bio-rad，美國)；PCR儀器(Applied Biosystems，美國)。

1.3 全基因組提取及PCR擴增

將平板單菌落挑到含有10% FBS的TSB培養基中培養12 h，細菌基因組提取試劑盒提取DNA，NanoDrop 2000分析DNA濃度和純度，-20 ℃保存備用；分別用多殺性巴氏桿菌特異性引物(Kmt)、莢膜基因分型引物(PmA、PmB、PmD、PmE和PmF)、脂多糖基因分型引物(L1-L8)、MLST分型擴增引物(adk、aroA、deoD、gdhA、g6pd、mdh和pgi)、σ 因子基因(rpoE)引物PCR擴增，總體系均為50 μL，分別將PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像儀拍照保存。

表1 多殺性巴氏桿菌基因擴增相關引物信息Table 1 Related primer information of P. multocida

表1(續)

1.4 基因克隆及測序

將陽性產物進行膠回收，過夜連接載體pMDTM-18T，轉化至DH5α 感受態細胞，在含100 μg/mL Amp+LB固體培養基過夜培養，挑取單菌落于100 μg/mL Amp+LB液體培養基過夜培養，PCR鑒定，將陽性送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5 測序結果分析

將所有測序結果在NCBI中比對，并下載參考序列；將測序完成的管家基因的序列提交至專門的MLST在線數據庫(PasteurellamultocidaMLST Databases：http:∥pubmlst.org/pmultocida/)進行比對明確每個基因T型，并確定牦牛源多殺性巴氏桿菌的ST型；利用MEGA 7.0 對rpoE基因序列進行分析，并構建系統發育進化樹。

1.6 rpoE基因生物信息學分析

利用蛋白質在線工具Prot-Param(https:∥web.expasy.org/protparam/)分析RpoE蛋白質的理化性質(分子質量、氨基酸組成、等電點和不穩定系數等)；

利用ProtScale(https:∥web.expasy.org/protscale/)分析RpoE蛋白的親水和疏水性；

利用TMHMM Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測rpoE基因的跨膜結構域分析；

利用SignalP 4.0 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)對rpoE基因信號肽分析；

通過在線分析工具PSORT Prediction(http:∥psort1.hgc.jp/form.html)可對rpoE基因進行亞細胞定位預測分析；

利用SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)和NCBIConserved Domains(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在線程序預測RpoE蛋白保守結構域分析；

利用NetPhos 3.1 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測RpoE潛在氨基酸磷酸化位點；

利用在線軟件SOPMA(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預測RpoE蛋白的二級結構；

利用在線軟件SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org/)預測RpoE蛋白的三級結構；

利用IEDB(http:∥tools.iedb.org/bcell/)和BCPREDS(http:∥ailab-projects1.ist.psu.edu:8080/bcpred/predict.html)在線程序預測RpoE蛋白B細胞線性抗原表位；

利用STRING Version:11.0(https:∥string-db.org/)分析RpoE蛋白與其他蛋白互作關系。

2 結果與分析

2.1 牦牛源多殺性巴氏桿菌莢膜、脂多糖和管家基因擴增

經過對細菌引物PCR擴增，結果見圖1～3。

M：DL 2 000 DNA分子量標準；N：陰性對照；1： 16S rDNA 片段；2： Kmt基因；3～7：莢膜分型(A、B、D、E和F)；8～15：脂多糖分型(L1～L8) M: DL 2 000 DNA Marker; N: Negative controls; 1: 16S rDNA fragment; 2： Kmt gene; 3-7: Classification of capsule (A、B、D、E and F); 8-15: Classification of lipopolysaccharide (L1-L8)圖1 牦牛源多殺性巴氏桿菌莢膜和脂多糖分型Fig.1 Classifications of Pasteurella multocida capsule and lipopolysaccharide from yak

M：DL 2 000 DNA分子量標準；N：陰性對照；1： 16S rDNA 片段；2： Kmt gene；3～9：管家基因(adk、aroA、deoD、gdhA、g6pd、mdh和pgi) M: DL 2 000 DNA Marker; N: Negative controls;1: 16S rDNA fragment; 2： Kmt gene; 3-9: Housekeeping gene (adk、aroA、deoD、gdhA、g6pd、mdh and pgi)圖2 牦牛源多殺性巴氏桿菌管家基因擴增Fig.2 Gene amplification of P. multocida house from yak

M：DL 2 000 DNA分子量標準；N：陰性對照；1： 16S rDNA 片段；2： Kmt gene；3：rpoE基因 M: DL 2 000 DNA Marker; N: Negative controls; 1: 16S rDNA fragment; 2: Kmt gene; 3: rpoE gene圖3 牦牛源多殺性巴氏桿菌rpoE基因擴增Fig.3 Gene amplification of P. multocida rpoE from yak

細菌通用引物16S rDNA擴增出了長約1 400 bp條帶；B型引物擴增出了長約760 bp條帶，其他莢膜分型引物均未擴增出；L2型引物擴增出了約810 bp條帶，其他脂多糖分型均無條帶；7對管家基因均能擴增出條帶，且符合預期條帶大小。rpoE基因引物進行PCR擴增，條帶大小約460 bp。結果表明：該株牦牛源多殺性巴氏桿菌為莢膜B型和脂多糖L2型。

2.2 牦牛源多殺性巴氏桿菌MLST分型鑒定

將測序結果在PasteurellamultocidaMLST數據庫中比對7個管家基因的等位基因，結果如表2，表明該株牦牛源多殺性巴氏桿菌MLST分型為ST44型。

表2 管家基因在線比對分析Table 2 Online comparison of housekeeping gene

2.3 牦牛源多殺性巴氏桿菌rpoE基因進化樹分析

將測序序列比對后，該西藏牦牛源多殺性巴氏桿菌rpoE基因和印度牛源多殺性巴氏桿菌(CP023305.1)的rpoE基因相似性100%，和其他多殺性巴氏桿菌rpoE基因序列存在10處堿基差異，但僅有第27位氨基酸發生了S→F突變；另外，第471位氨基酸(E)僅與法國兔源多殺性巴氏桿菌(CP020347.1)RpoE蛋白的氨基酸(K)有差異。通過和19株參考序列比對做基因發育進化樹(圖4)，西藏牦牛源多殺性巴氏桿菌rpoE基因，與荷蘭(CP026744.1)、美國(CP044077.1)人源，韓國(CP049756.1)貓源多殺性巴氏桿菌差異性較大，相似性分別為38.7%、38.4%和38.7%，位于不同分支，除牛源以外的其他源多殺性巴氏桿菌rpoE基因差異性較小。

2.4 rpoE基因編碼蛋白特性分析

通過Port-Param在線分析RpoE蛋白的一級結構，結果表明rpoE基因序列長576 bp，編碼191個氨基酸，分子式為C967H1 544N268O304S6，分子量為22.0 ku，理論等電點4.86，20種氨基酸中無組氨酸(H)，谷氨酸(E)占比最多9.9%(表3)，負電荷(Asp+Glu)的殘基總數31個，正電荷(Arg+Lys)的殘基總數24個，脂肪指數90.37，總平均親水性(GRAVY)為-0.440，在哺乳動物體外網織紅細胞內半衰期約為30 h，大腸桿菌屬和酵母內半衰期分別大于10和20 h，消光系數為17 420，不穩定性指數為46.14，屬不穩定性蛋白。

標尺表示遺傳距離，指每個位點有0.000 5個氨基酸替換。 Scale bar indicates genetic distance. Number 0.000 5 represents 0.000 5 aa substitutions per site.圖4 rpoE基因進化樹分析Fig.4 rpoE gene evolution tree analysis

表3 RpoE蛋白氨基酸含量Table 3 RpoE protein amino acid content

2.5 RpoE蛋白親疏水性和跨膜結構分析

通過Prot-Param在線分析，已知本分離株RpoE蛋白的GRAVY為負值，表示具有親水性；利用在線分析工具Protscale可對蛋白親疏水性進行分析，多肽鏈第93位的Pro(P)具有最低的分值-2.956，第134位的Thr(T)具有最高的分值1.300；從整體看，親水性氨基酸多于疏水氨基酸，表明了RpoE為親水性蛋白。通過TMHMM Server在線程序，對RpoE蛋白跨膜結構域進行分析，結果氨基酸殘基在螺旋中、內部或外部的總概率求和概率無波峰，表明預測該蛋白無跨膜區域，見圖5。

2.6 RpoE蛋白激酶磷酸化位點、信號肽和細胞定位分析

通過NetPhos3.1 Server服務器進行激酶特異性磷酸化位點預測，結果Ser(S)、Thr(T)、Tyr(Y)預測得分高于0.5的個數分別為10、5和2，表明該蛋白氨基酸潛在的磷酸化位點有17個。通過SignalP 4.0 Server服務器分析RpoE蛋白信號肽，S平均值<0.5，表明該蛋白無信號肽，不能向其他通路轉移或進入其他膜結構的亞細胞內。rpoE基因定位的亞細胞結構，在很大程度上與該基因編碼蛋白的功能密切相關，通過PSORT Prediction在線分析，結果顯示該基因定位在細胞質、線粒體基質、溶酶體(腔)、內質網(膜)的得分分別為0.650、0.100、0.100和0.000，表明該基因在細胞質中表達的可能性極大(圖6)。

(a)RpoE蛋白親疏水性分析；(b)RpoE蛋白跨膜結構分析(a) Analysis of RpoE protein hydrophobicity； (b) Analysis of RpoE protein transmembrane structure圖5 RpoE蛋白親疏水性和跨膜結構分析Fig.5 RpoE analysis of protein hydrophobicityand transmembrane structure

(a)RpoE蛋白激酶磷酸化位點分析； (b)RpoE蛋白信號肽分析(a) RpoE protein kinase phosphorylation site analysis； (b) RpoE protein signal peptide analysis圖6 RpoE蛋白激酶磷酸化位點和信號肽分析Fig.6 RpoE protein kinase phosphorylation site and signal peptide analysis

2.7 RpoE蛋白結構域分析

通過SMART在線分析RpoE蛋白保守結構域，RpoE蛋白在PFAM數據庫中有Sigma70_r2、Sigma70_r4_2個結構域，氨基酸位點分別在25～92、128～181，均為RNA聚合酶Sigma因子；利用NCBI CD Search在線分析，結果有3種類型的匹配：特定匹配(specific hits)和超家族(superfamily)蛋白PRK09652、RpoE superfamily，非特定匹配(non-specific hits)和超家族(superfamily)蛋白RpoE Sigma70 superfamily，均為Sigma-70家族RNA聚合酶sigma因子；保守位點氨基酸有13個，均為DNA結合殘基位點。2次分析結果一致，利用NCBI分析RpoE蛋白保守結構域結果相對更豐富(圖7)。

(a)SMART在線分析；(b)NCBI CD search在線分析(a) SMART online analysis； (b) NCBI CD search online analysis圖7 RpoE蛋白結構域分析Fig.7 RpoE protein domain analysis

2.8 RpoE蛋白二級和三級結構預測

通過在線軟件SOPMA在線分析顯示，由圖8可知，RpoE蛋白有4種結構存在，分別是：α-螺旋(h)、無規則卷曲(c)、延伸鏈(e)和β-轉角(t)。α-螺旋占比67.02%，β-轉角占比4.71%。通過SWISS-MODEL在線數據庫對牦牛源多殺性巴氏桿菌RpoE蛋白進行同源建模，分析表明與大腸桿菌RNA聚合酶sigma E模型相似度最高為74.35%，GMQE為0.87，QMEAN為-0.52，基本可以認為模型完全代表了真實結構，并可用它進行虛擬篩選、分子對接等功能結構研究，選擇該蛋白進行同源性建模(圖9)。

2.9 RpoE蛋白B細胞線性抗原表位預測

通過IEDB在線分析RpoE蛋白B細胞線性抗原表位預測，最高分1.146，平均得分1.019，共預測到6個線性抗原表位；利用BCPREDS在線分析，線性表位預測長度為20個氨基酸，特異性為75%，結果共預測到4個線性抗原表位(圖10)。2種分析方法均表明該蛋白表面存在線性抗原表位，但2種方法預測存在差異。

2.10 RpoE與其他蛋白之間的互作預測

通過STRING Version11.0分析多殺性巴氏桿菌RpoE蛋白與其他蛋白之間的關系，在10個蛋白中有24條相互作用線，蛋白之間連線顏色差異表示不同的相互作用途徑，顏色越多，表明2種蛋白之間有更為密切的互作關系。經分析發現：RpoE蛋白和替代 σ 因子RpoH、RseB、RNA聚合酶σ因子RpoD、arcB、sodC、RNA結合蛋白hfq、DR93_94、DR93_141、抗RpoE RseA N-端結構域蛋白DR93_149和DR93_151蛋白的編碼基因中存在基因鄰域、基因組間協同、基因共表達和基因融合等現象，與抗RpoE RseA N端結構域蛋白DR93_149相互作用的綜合得分最高為0.999，其主要功能為參與脂多糖的合成和調節外界環境脅迫的耐受能力等(圖11)。

h：α-螺旋；c：無規則卷曲；e：延伸鏈；t：β-轉角 h: Alpha helix； c: Random coil； e: Extended strand； t: Beta bridge圖8 RpoE蛋白二級結構預測Fig.8 RpoE protein secondary structure prediction

(a)Ball+Stick模型； (b) Spacefill模型(a) Ball+Stick model; (b) Spacefill model圖9 RpoE蛋白三級結構預測Fig.9 RpoE protein tertiary structure prediction

(a)IEDB在線分析；(b)BCPREDS在線分析(a) IEDB online analysis; (b) BCPREDS online analysis圖10 RpoE蛋白B細胞線性抗原表位預測Fig.10 Prediction of B cell linear antigen epitope of RpoE protein

3 討 論

目前，我國雖有商品化的牛多殺性巴氏桿菌滅活疫苗，但疫苗株和西藏牦牛源多殺性巴氏桿菌存在一定差異，迫切需要鑒定西藏牦牛源Pm的基因型，并利用西藏牦牛源多殺性巴氏桿菌研發高效、可靠的疫苗。通過分子學方法鑒定西藏地區牦牛源Pm為莢膜B型、脂多糖L2型、管家基因ST44型，與鄔琴等[38]對新疆牦牛源Pm對比分型一致，表明新疆牦牛源Pm與西藏地區牦牛源Pm有較高的相似性。Sarangi等[39]、Alex等[40]和Peng等[15,41]在Pm基因分型中的研究表明，不同地理區域、不同宿主動物Pm的基因型有一定差異，但同一宿主的Pm具有“基因型偏好”現象。也有報道青海牦牛源多殺性巴氏桿菌存在莢膜A型，但并未進行多方面基因分型。牦牛源Pm基因分型是否具有一定的“基因型偏好”，還需要大量基因分型鑒定驗證。

RpoE蛋白是細菌在應對外界環境變化的內部調節 σ 因子，在兔源和牛源Pm中編碼的RpoE蛋白有著較強的毒力作用和免疫原性[32,37]。通過分子生物學分析rpoE基因及其編碼蛋白發現，西藏牦牛源rpoE基因全長576 bp，其基因序列和印度牛源Pm的rpoE基因完全一致，相似度100%。本課題組曾將Pm特異性基因Kmt進行測序比對，和印度牛源Pm的特異性基因同源性較高[4]，結合本次rpoE基因比對結果，進一步證明了西藏牦牛源Pm與印度牛源Pm存在很近的親緣關系，應加強進出口檢疫防控。利用生物信息學方法對牦牛源PmrpoE基因及其編碼蛋白RpoE分析，預測出該蛋白分子量為22.0 ku，理論等電點4.86，為不穩定、無跨膜結構、無信號肽、有潛在磷酸化的胞內親水性蛋白，這表明該蛋白可能在胞內進行表達，通過抗原和抗體結合進行信號的傳導。RpoE蛋白有多個抗原表位，可能和二級結構中α-螺旋、自由卷曲的存在有關[42]，三級結構模型為棒狀微彎曲，可較大面積與B細胞抗原結合，可能為良好的候選疫苗抗原[37]。由于BCPREDS在線分析中抗原決定簇氨基酸數量限制較大，與IEDB在線分析相比抗原表位預測少2個，但均表明RpoE蛋白存在抗原表位。在預測RpoE蛋白互作中，發現與10個蛋白存在共表達、基因共現、基因融合等相互作用，將為深入了解RpoE蛋白作用機制提供參考。Collinet等[43]發現RseB-RiseA相互作用，可調節rpoE基因RNA聚合酶的組裝和熱休克反應，Kloska等[44]研究表明通過誘導RpoE和抑制RpoD σ 因子來介導冷應激反應。本研究通過生物信息學分析發現rpoE基因在西藏牦牛源Pm中可能是潛在的毒力基因，在環境脅迫的過程中有潛在的調節作用，若要明確RpoE蛋白的具體作用，還需要進一步研究該蛋白在牦牛源Pm中的作用機制。

4 結 論

本研究成功鑒定了一株實驗室保存的西藏牦牛源Pm為B∶L2∶ST44型，對RpoE蛋白結構分析發現，蛋白質無信號肽和跨膜結構，二級結構α-螺旋占比最高，三級結構模型為棒狀微彎曲，是存在至少4個抗原表位的胞內親水性蛋白。推測RpoE蛋白有望成為Pm的疫苗候選抗原，將為后續深入研究RpoE蛋白的相關疫苗和疫病防控提供數據參考。