H9N2亞型禽流感病毒分離鑒定及免疫試驗

許佳敏 邊海霞

摘要：為了更好防控H9N2亞型禽流感，且做到科學免疫，免疫減負。本研究采集疑似感染低致病禽流感雞群病料，將其無菌處理后接種SPF雞胚后進行病毒分離，通過分子生物學試驗對其進行病原學鑒定。結果顯示：分離鑒定出一株H9亞型禽流感病毒（AIV）；血凝試驗（HA）效價在10～11，該病毒屬于歐亞分支的BJ亞分支。將病毒純化后，制備滅活疫苗免疫SPF雞，免疫后14d對其進行HI檢測，結果顯示其效價到達峰值為10Log2，免疫后28～35d其平均效價在9.6Log2，至免疫后12周平均效價在7Log2。結果說明本研究分離的病毒制備成疫苗后具有較好的免疫效果，可以作為疫苗候選株。

關鍵詞：H9N2亞型禽流感毒株，免疫，疫苗

禽流感是禽流行性感冒（avian Influenza，AI）的簡稱，是由正粘病毒科（orthomyxoviridae）、流感病毒屬（influenza virus）、A型流感病毒（influenza A virus）引起的禽類疾病[1]。國際獸醫局（OIE）將禽流感列為A類動物疫病，我國也將其定為一類動物傳染病。

H9N2禽流感病毒是低致病性亞型，在世界各地家禽群中流行。目前，H9N2引起的禽流感在我國呈地方流行，雖然死亡率低，但感染蛋雞出現雞輸卵管功能異常，產褪色蛋、畸形蛋、砂皮蛋、軟殼蛋，雞群產蛋率下降30%～80%，病程持續時間長的可達月余，造成嚴重的經濟損失[2]。該疾病可通過免疫疫苗進行抵御但是由于低致病禽流感變異速度快，不同血清型之間交叉保護有限；所以篩選、免疫對型疫苗對養殖業具有重要意義[3]。本研究通過分子病原學及血清學分離鑒定一株H9N2流行毒株，并進行動物試驗，為進一步篩選疫苗提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料來源疑似發病雞病料，采集自寧夏平羅縣某商品蛋雞養殖場。

1.1.2試劑和設備禽流感抗H9亞型標準陽性血清由哈爾濱獸醫研究所提供；OneStepPCRMix購自北京全式金生物；PCR儀購自羅氏；RNA提取試劑盒購自羅氏；高速冷凍離心機購自湘儀。

1.1.3試驗動物試驗用SPF雞種蛋，購自北京勃林格英格翰公司

1.1.4引物設計參照GenBank中已發表的H9N2AIV的HA基因序列，設計一對鑒定引物，序列為：AI-F（5-3）：CTCCACACAGAGCAYAATGG；AI-R（5-3）：GYACACTTGTTGTTGTRTC；擴增基因片段大小均為488bp。測序引物系列：HA-F（5-3）：AGCRAAAGCAGGGGAATTTC；HA-R（5-3）：AGTAGAAACAAGGGTGTTTT；擴增基因片段大小均為1800bp。引物由上海生工生物技術有限公司合成。

1.2方法

1.2.1病毒基因組RNA提取采集疑似發病雞群病料及肛咽拭子；將其無菌處理后，根據羅氏病毒RNA提取試劑盒操作步驟，提取核酸。使用鑒定引物根據全式金生物一步法進行PCR擴增，擴增程序為：94℃2min；94℃30s，53℃30s，72℃2min，30個循環； 72℃10min；擴增完畢后進行凝膠電泳，觀察是否有目的片段。

1.2.2病毒分離及鑒定將1.2.1無菌處理的肛咽拭子樣品吸取上清，使用0.22μm濾器過濾，以0.2mL/只接種9～10日齡SPF雞胚，棄去24h內死亡雞胚，將24～96h死亡和存活雞胚放于4℃過夜或放于-20℃2h后無菌收集尿囊液。檢測尿囊液效價，對于有效價尿囊液重復1.2.1操作，擴增完畢后進行凝膠電泳，觀察是否有目的片段；無效價尿囊液重復接種雞胚。

1.2.3序列測定、同源性分析將含有目的片段的PCR產物送至上海生工進行測序分析。測序結果經過整理、拼接，獲得完整的HA基因序列。利用MEGA4及MegAlign軟件進行分析。

1.2.4免疫血清的制備將收獲的雞胚尿囊液按油乳劑疫苗的制備方法制備滅活疫苗，檢驗合格后，經胸肌接種20只21日齡SPF雞，0.5mL/只，同時設空白對照組。于免疫后2周、4周、6周、8周、12周采血，分離血清，分別保存備用。

2結果

2.1 PCR反應與序列鑒定

病料樣品處理后接種9～10日齡SPF雞胚，在培養的72h內未出現雞胚死亡，72h后測其尿囊液，HA效價為10log2，并且HA陽性尿囊液的血凝性能夠被AIV-H9標準陽性血清所抑制，而不能被抗NDV、EDSV、AIV-H5陽性血清所抑制，表明該分離株為H9亞型AIV。進一步利用H9鑒定引物對分離株HA基因進行擴增，得到與預期大小（約488bp）相符片段（見圖1）。同時利用測序引物進行擴增送至上海生工技術公司進行測序，測序結果經BLAST比對分析發現，與其匹配度高的幾種序列全部為H9亞型禽流感序列，根據MEGA4及MegAlign軟件分析，結果顯示該病毒與歐亞BJ亞分支同源性99.8%～95.0%，進一步證實該分離株為H9亞型禽流感。

2.5免疫試驗結果

免疫后2周抗體效價上升至10Log2，顯著高于國標的6.5log2，免疫后4～5周抗體效價維持在9.6Log2滴度，具有較好的保護力度。隨后抗體效價逐漸消減，至免疫后12周抗體效價水平維持在7Log2。

3討論

1994年，我國分離到第一株H9N2亞型禽流感病毒后，H9N2亞型禽流感病毒在我國禽類中廣泛流行，對養禽業造成了巨大經濟損失[4]。雞群感染H9亞型禽流感后產蛋率下降較明顯，所以養殖業對H9亞型禽流感病毒的防控十分重視。本試驗通過病毒分離，血清學試驗為選用H9疫苗提供依據，同時為防控H9N2亞型禽流感提供新思路。█

參考文獻：

[1]于力，于康震，徐宜為.動物傳染病學[M].北京：中國農業出版社，1999.

[2]孫泉云，陳琦，夏爐明.H9N2亞型禽流感流行現狀[J].動物醫學進展，2011（10）： 107-111.

[3]欒棟祖，王淑平，臧金來，等.肉雞溫和型禽流感（H9N2）的防治[J].中國動物檢疫，2009，26（8）：53-54.

[4]劉紅旗，劉秀梵，張如寬.A型流感病毒蛋白研究進展[J].動物醫學進展，2002，23（2）：6-9.