鴨腸炎病毒gD蛋白亞細胞定位及其對病毒感染相關作用分析

張楊子 王璇 吳玙彤 潘淑惠 文正常 文明

摘要：本試驗旨在研究鴨腸炎病毒（DEV）gD蛋白亞細胞定位及其對病毒感染的相關作用。本研究經過對DEV病毒擴增處理，利用原核表達系統獲得重組gD基因胞外區蛋白（gDw），以兔抗gDw IgG為抗體，進行免疫熒光反應，對比病毒對照組，檢查gD蛋白在吸附、侵入以及傳播之間起到的作用。結果表明，經過熒光顯微鏡觀察，接種DEV后4h可見綠色熒光，主要在細胞核附近。持續觀察6～24h發現熒光隨著時間增加明顯加強，細胞輪廓清晰，主要存在于胞漿中。激光顯微鏡下觀察接種DEV后4h可觀察到綠色熒光，經過PI染色12h后可見綠色熒光更加明顯，主要在胞漿中呈現，在胞核內沒有出現特異性熒光。染色后72h可在細胞膜上觀察到綠色熒光，且輪廓清晰。添加兔抗gDw IgG不會影響病毒粒子吸附率，在病毒粒子吸附中糖蛋白D并未產生明顯作用。觀察組吸附率和噬斑數與對照組有顯著差異（P<0.05），添加兔抗gDw IgG后可有效降低病毒粒子侵入DEF，糖蛋白D具有阻止病毒侵入DEF的作用。添加兔抗gDw IgG后病毒噬斑直徑明顯減小，證實了在DEV細胞之間傳播過程中糖蛋白D起到抵抗作用。DEF感染DEV后2h可檢查到gD基因轉錄，經過免疫熒光實驗，4h后可合成gD蛋白，出現在核膜和核周，12h出現在胞漿上，72h出現在細胞膜上。DEVgD參與病毒侵入以及細胞之間傳播的作用，對于病毒吸附不明顯，添加gDw Igw抗體后，細胞病變具有延遲反應。

關鍵詞：鴨腸炎；病毒gD蛋白；亞細胞定位；病毒感染作用

鴨腸炎即鴨瘟，是由鴨腸炎病毒（DEV）引發的禽類感染傳染病，具有較強的傳染性，發病急，死亡率高[1]。一般情況下，禽類感染潛伏期約為3～5d，患病鴨表現出愛獨處，頭頸卷縮，雙腳麻痹，羽毛松亂，不愿意行走。隨著病情惡化開始腹瀉，排泄物呈白色或綠色，有腥臭味，食欲減退、肛門紅腫[2]。經過解剖，患鴨出現體腔積血以及組織出血，存在器官壞死。gD蛋白亞細胞是病毒傳播的重要蛋白，具有中和病毒作用，作為一種中和抗原，能夠誘導保護反應，鴨腸炎疫苗就是通過將病毒結構蛋白作為抗原免疫，從而達到預防作用。通過研究gD蛋白定位和感染病毒作用，能夠實現鴨腸炎的預防和治療。

1資料與方法

1.1實驗材料

采購10日齡左右的鴨胚，制備鴨胚成纖維細胞（DEF）[3]。采購鴨腸炎病毒弱病株。準備分子生物學試劑以及生化試劑。準備DMEM細胞培養基、低熔點瓊脂糖。配置PBS緩沖液、甲醇固定液以及碳酸鹽緩沖液等。

1.2方法

1.2.1 gD蛋白亞細胞定位根據gD基因序列，收集不同感染時間的DEF，并取正常細胞為對照組。提取RNA，經過酶處理后，進行PCR擴增反應，將產物電泳處理。將DEV接種在載玻片上，接種1、2、4、6、12、24、72h后收獲細胞。使用PBS溶液進行單層細胞的沖洗，同時使用多聚甲醛進行固定處理，重復沖洗3次。使用PBS溶液處理細胞。沖洗后使用羊抗兔IgG孵育1h，用PI染色液染色處理，再次用PBS沖洗，固定在載玻片上，進行顯微鏡觀察。

1.2.2 gD蛋白對病毒的感染作用

1）吸附作用。將病毒溶解于DMEM（無血清）、兔抗gDw IgG、兔陰性血清中，接種單層DEF，處理2h去除接種物，使用PBS進行沖洗，將沒有結合的游離粒子沖洗干凈。在37℃條件下進行培養，對照組不需進行沖洗，直接覆蓋低熔點瓊脂糖。

2）侵入作用。將病毒溶解于DMEM（無血清）、兔抗gDw IgG、兔陰性血清中，在37℃條件下進行處理1h，丟棄接種物。對照組使用PBS溶液進行清洗，觀察組使用醋酸鹽緩沖液進行沖洗，經過2min處理后，侵入粒子完全滅活。

3）傳播作用。使用半固體營養瓊脂充分吸收釋放病毒粒子，DEV通過細胞之間直接傳播形成噬斑。用病毒進行接種，然后覆蓋有DMEM的營養瓊脂經過培養后形成噬斑。進行染色處理后，測量噬斑直徑。觀察組中含有兔抗gDw IgG。

1.3統計學方法

采用SPSS 23.0軟件處理數據，使用t檢驗計量資料，結果以平均值±標準差表示；使用卡房檢驗計數資料（%），P<0.05視為差異有統計學意義。

2結果

2.1 gD蛋白亞細胞定位

經過熒光顯微鏡觀察，正常DEF在激發光下沒有發現特異性熒光，經過PI染色后呈紅色，可見橢圓形清晰輪廓。接種DEV后4h可見綠色熒光，主要在細胞核附近。持續觀察6～24h發現熒光隨著時間增加明顯加強，細胞輪廓清晰，主要存在于胞漿中。激光顯微鏡下沒有觀察到DEF出現特異性綠色熒光。觀察組接種DEV后4h可觀察到綠色熒光，經過PI染色12h后可見綠色熒光更加明顯，主要在胞漿中呈現，在胞核內沒有出現特異性熒光。染色后72h可在細胞膜上觀察到綠色熒光，且輪廓清晰。

2.2病毒gD蛋白對病毒吸附前后噬斑的變化

觀察組處理后噬斑（64.71±2.54）個，吸附率（71.29±1.34）%。2組對比，無明顯差異。具體結果詳見表1。

2.3病毒gD蛋白對病毒侵入前后噬斑的變化

觀察組處理后噬斑（51.56±1.70）個，侵入率（65.12±2.31）%。兩組對比，差異顯著（P<0.05）。具體結果詳見表2。

2.4病毒gD蛋白對細胞間傳播前后噬斑的變化

觀察組噬斑直徑（1.25±0.06）mm。兩組對比，差異顯著（P<0.05）。具體結果詳見表3。

3討論

gD是病毒囊膜的重要構成部分，對病毒侵入細胞有重要意義，負責病毒包膜的融合和病毒釋放與擴散的介導作用。在病毒復制和中和抗體中gD也產生重要作用，是體液免疫、宿主細胞免疫的重要靶標。若病毒缺少gD基因，無法和細胞膜發生吸附作用，將造成病毒失去感染能力[4]。在病毒基因組中有至少80多個基因產物，但合成gD主要出現在病毒感染的早期，在DNA復制后合成，當病毒復制活躍后，6～12h開始大量聚集。通過免疫熒光技術可觀察到感染4h后gD在核周囊泡上定位[5]。本研究也顯示，經過熒光顯微鏡觀察，正常DEF在激發光下沒有發現特異性熒光，經過PI染色后呈紅色，可見橢圓形清晰輪廓。接種DEV后4h可見綠色熒光，主要在細胞核附近。持續觀察6～24h發現熒光隨著時間增加明顯加強，細胞輪廓清晰，主要存在于胞漿中。使用激光顯微鏡進行觀察，沒有觀察到DEF出現特異性綠色熒光。觀察組接種DEV后4h可觀察到綠色熒光，經過PI染色12h后可見綠色熒光更加明顯，主要在胞漿中呈現，在胞核內沒有出現特異性熒光。染色后72h可在細胞膜上觀察到綠色熒光，且輪廓清晰。可見gD定位表現出動態變化過程，和gD發揮功能以及DEF增殖存在密切關聯性。在感染后4～6h為糖蛋白合成的活躍時期，從核膜向胞漿上轉移，顯微鏡可觀察到綠色熒光增加。感染24h后gD大量合成，胞漿內病毒數量增加，向胞外釋放。在72h后觀察到細胞膜上出現明顯綠色熒光。

經本試驗研究，添加gD抗體后會延遲DEV病變的發生，病變局限在少數細胞中，無法形成大范圍噬斑，也證明了DEV感染過程是一個膜融合的過程。本研究顯示，添加兔抗gDw IgG不會影響病毒粒子吸附率，在病毒粒子吸附中糖蛋白D并未產生明顯作用。主要對病毒侵入和細胞之間感染產生抑制作用。gD并不會錨定包膜上，gD抗體中和病毒會造成病毒gD數量減少，從而影響病毒的侵入以及傳播，最終造成病變延遲。本研究也顯示，觀察組處理后噬斑（51.56±1.70）個，侵入率（65.12±2.31）%。觀察組與對照組對比，差異顯著，證實觀察組吸附率和噬斑數和對照組有顯著差異，添加兔抗gDw IgG后可有效降低病毒粒子侵入DEF，糖蛋白D具有阻止病毒侵入DEF的作用。觀察組與對照組對比，差異顯著。添加兔抗gDw IgG后病毒噬斑直徑明顯減小，證實了在DEV細胞之間傳播過程中糖蛋白D起到抵抗作用。目前關于gD蛋白的基因研究還相對較少，未來還需要針對gD亞單位疫苗、gD核酸疫苗展開研究，從而有效預防和治療鴨腸炎。

4小結

綜上所述，DEF感染DEV后2h可檢查到gD基因轉錄，經過免疫熒光試驗，4h后可合成gD蛋白，出現在核膜和核周，12h出現在胞漿上，72h出現在細胞膜上。DEVgD參與病毒侵入以及細胞之間傳播的作用，對于病毒吸附不明顯，添加gDw Igw抗體后，細胞病變具有延遲反應。█

參考文獻：

[1]張旭，鄭敏，吳征卓，等.鴨腸炎病毒感染對鴨十二指腸轉錄組的影響[J].動物醫學進展，2020，41（10）：73-79.

[2]楊霞，蒲翠敏，胡安東，等.鴨腸炎病毒感染對鴨腸道菌群多樣性的影響[J].中國預防獸醫學報，2020，42（8）：772-778.

[3]張旭，吳征卓，姚碧瓊，等.鴨腸炎病毒感染對鴨腸道黏膜組織轉錄組變化分析[J].基因組學與應用生物學，2020，39（5）：1972-1981.

[4]毛婭卿，張兵，王團結，等.UL56基因下游3513bp對鴨腸炎病毒生物特性的影響[J].中國農業科學，2019，52（23）：4390-4397.

[5]孫瑩，張兵，李嶺，等.表達H9亞型禽流感病毒HA基因重組鴨腸炎病毒的構建[J].中國農業科學，2019，52（23）：4398-4405.