高效液相色譜法快速測定紅糖中丙烯酰胺

鄭莛予，陳杰博，王 璐，鄭明鋒，汪 鵬，褚杜娟

(1福建農林大學食品科學學院，福建福州350002；2福建農林大學國家甘蔗工程技術研究中心，福建福州350002；3福建農林大學生命科學學院/農業生態研究所，福建福州350002)

0 引言

丙烯酰胺(Acrylamide)，其化學式為 C3H5NO，在常溫下為白色晶體狀，無氣味，易溶于水、乙醇、丙酮等極性溶劑中。人體可以通過消化道、呼吸道、皮膚黏膜等多種途徑接觸并吸收丙烯酰胺。1993年世界衛生組織將其評估為致癌風險物質。1994年，丙烯酰胺被國際癌癥研究機構列為2A級致癌物[1]。2002年4月，瑞典國家食品管理局宣布在加工食品中發現了丙烯酰胺，此后食品中的丙烯酰胺得到了廣泛的關注[2]。加工食品中的丙烯酰胺多產生于食品內部的美拉德反應，因此在咖啡、面包、薯片或其他經過熱處理的淀粉類食品陸續檢測出了丙烯酰胺[3-8]。

在中國，紅糖不僅作為一種甜味劑，還是一種功能食品，中醫認為紅糖具有滋補氣血、健脾養胃等功能，女性在月子、月經期間大量飲用紅糖及其制品，這被認為具有排惡露和暖宮的作用。現代研究表明，紅糖富含酚類、維生素、礦物質以及多種人體必需氨基酸等營養物質[9]，具有抗氧化、防衰老和美容養顏等功效。作為紅糖生產的原料——甘蔗汁，其富含葡萄糖、果糖等還原糖和天冬氨酸等氨基酸，這些在蔗汁熬煮過程中通過美拉德反應和褐變反應，使紅糖產生特有的香味和顏色，也產生了中醫認為的紅糖的溫熱屬性，但同時，還原糖與氨基酸發生的美拉德反應也容易產生如丙烯酰胺、5-羥甲基糠醛等有害物質。Hoenicke[10]、Cheng[11]采用LC/MS/MS和GC-MS等對當地紅糖/黑糖的丙烯酰胺進行了抽樣檢測；Gómez-Narváez[12]等對南美洲和歐洲等國家的 2種不同外觀形式的紅糖“Panela”共計40款進行了丙烯酰胺檢測，這2種形式的紅糖中均檢測出了丙烯酰胺，部分紅糖中的丙烯酰胺含量高達2632 ug/kg±111 ug/kg。但是，目前食品中丙烯酰胺的檢測方法主要是基于高淀粉類食品，采用高效液相色譜-質譜聯用法、氣相色譜-質譜聯用法、毛細管電泳法等[13-14]。質譜在定量檢測中運用廣泛，且具有更高的靈敏度與精確度，但質譜的檢測成本昂貴，對儀器、試劑和樣品的前處理要求很高，大多需要對樣品進行衍生化或固相萃取技術。Castle[15]等對丙烯酰胺的溴化使其具有了高揮發性，使得溴化后的丙烯酰胺可應用于氣相色譜檢測中，提高了檢測的選擇性，但溴化方法費時費力，反應時間長，需要嚴苛的溫度控制，并且溴化液對環境造成污染。Pedersen[16]等基于索氏提取方法，用甲醇連續提取樣品10天后無需衍生化便可用GC-MS進行檢測。Cavalli[17]等采用固相萃取設備(SPE)與加速固相萃取裝置(ASE)結合對樣品進行除雜處理，丙烯酰胺的回收率為60%～95%。Achim[18]采用離子肼LC-ESI-MS/MS檢測丙烯酰胺，檢出限低至0.55 ng/mL。紅糖主要成分是糖分，其最大的特點是具有高的水溶性，這些基于高淀粉樣品發展起來的檢測方法，由于需要對樣品中的淀粉、油脂等組分進行去除，存在著操作繁瑣、設備要求高、檢測成本高等問題。然而，紅糖的糖分和丙烯酰胺均為強極性物，這就需要更多關注強極性組分之間的分離作用，因此，開發如紅糖高水溶性樣品的丙烯酰胺快速、低成本的檢測方法，對保證紅糖食品安全具有重要的意義。

高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)具有高效、檢測成本低等優點。Hypercarb液相色譜柱采用獨特的100%多孔石墨碳作為填料，它的化學表面特性明顯區別于傳統的硅膠基質填料，如鍵合硅膠及聚合物等[19-20]，對高極性分析物具有出色的保留能力[21-22]。丙烯酰胺在210 nm左右有較強的紫外吸收，而蔗糖、葡萄糖等糖組分沒有紫外吸收，可以減少糖分對丙烯酰胺檢測的干擾。因此，采用HPLC-UV結合Hypercarb色譜柱，有望實現對紅糖中丙烯酰胺的快速高效低廉的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10種不同品牌的紅糖，購自福州超市和淘寶網；丙烯酰胺標準品(純度≥99%)，上海阿拉丁生化科技有限公司；甲醇(色譜純)，美國Thermo Fisher公司；實驗用水由Milli-Q超純水機系統制得。所有的試劑和溶液在進入檢測器之前都要用0.22 μm微孔過濾膜過濾，超聲除氣。

1.2 儀器與設備

Waters 2695高效液相色譜系統配2998光電二極管矩陣(PDA)檢測器，美國Waters科技有限公司；Hypercarb多孔石墨碳液相色譜柱(4.6 mm×100 mm，3 μm)，美國Thermo Fisher公司；電子分析天平(感量0.1 mg)，瑞士梅特勒-托利多國際有限公司。

1.3 方法

1.3.1 丙烯酰胺標準儲備溶液的配制

準確稱取丙烯酰胺標準品0.0500 g，用去離子水溶解后置于1000 mL容量瓶中，用去離子水定容，配置成質量濃度為50 μg/mL的丙烯酰胺溶液，再取1 mL該溶液于棕色容量瓶中稀釋至100 mL，配置成0.5 μg/mL的丙烯酰胺標準儲備液，置于4℃冰箱內保存備用。

1.3.2 紅糖樣品的前處理

分別取上述10種紅糖適量，研磨成粉，準確稱取0.50 g(精確到0.01 g)紅糖樣品充分攪拌溶解，配置成不同溶度的紅糖溶液，0.22 μm濾膜過濾后用于高效液相色譜分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱選擇 Hypercarb多孔石墨碳液相色譜柱(4.6 mm×100 mm，3 μm)；進樣量 20 μL；色譜柱溫度35℃；流速1.0 mL/min；流動相：甲醇-水(15∶85，V/V)；檢測波長：210 nm，利用保留時間定性，峰面積定量。

1.3.4 標準曲線的繪制

取不同體積(0.2、0.8、1.4、2.0、2.6、3.2 mL)的1.3.1節配制的丙烯酰胺標準儲備液，用去離子水定容于10 mL容量瓶中，渦旋振蕩搖勻，配制成濃度分別為 0.01、0.04、0.07、0.10、0.13、0.16 μg/mL的系列標準品工作液，分別進行HPLC分析。以質量溶度(μg/mL)為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算丙烯酰胺的線性范圍、回歸方程及相關系數。

在相同的色譜條件下進行樣品的測定，根據標準品丙烯酰胺的保留時間對樣品進行定性，根據峰面積和標準曲線進行定量，每個樣品平行測定3次，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 檢測波長

由于甲醇在200 nm處具有紫外吸收，而丙烯酰胺在190～240 nm之間有紫外吸收，因此，吸收波長的選擇對樣品檢測靈敏度有重要的影響。通過對15%甲醇水溶液流動相和丙烯酰胺標準溶液的全波長掃描比較，可以看到丙烯酰胺在200 nm處有最大的吸收(圖1)，但在210 nm處流動相的響應值遠低于200 nm處(圖1)，其紫外吸收光譜受流動相基質干擾小，故選擇210 nm作為檢測波長。

2.1.2 流動相的選擇

圖1 檢測波長對分離效果的影響

丙烯酰胺是強極性化合物，在反相色譜柱上的保留較弱，流動相常采用有機溶劑和水的混合物，通過調節流動相的比例，可以得到較為理想的分離效果。本研究采用黏度和毒性較低的甲醇進行優化實驗，同時考察流動相酸性對分離效果的影響，由圖2可見，隨著流動相甲醇含量的增加，流動相對丙烯酰胺的洗脫能力增強，其保留時間由 3.8 min減少至2.0 min，甲醇含量的增加，丙烯酰胺的峰型逐漸尖銳，當甲醇含量為15%時，基線平穩，沒有明顯的漂移，丙烯酰胺的峰型尖銳，對稱性良好，保留時間較為適宜，避開了雜質峰的干擾。而在流動相中添加磷酸時，基線漂移較為嚴重。綜上，選擇15%的甲醇水溶液作為流動相。

圖2 流動相對分離效果的影響

2.1.3 樣品濃度

紅糖大部分的組分具有較強的水溶性，紅糖溶液的濃度對丙烯酰胺與其他組分的分離有重要影響，紅糖水濃度高容易造成其他組分對丙烯酰胺色譜峰的掩蓋，而濃度低，丙烯酰胺峰不明顯。因此，采用15%甲醇水溶液作為流動相，1.0 mL/min的流速，210 nm檢測波長，圖3比較6種不同濃度的紅糖水溶液(1%、2%、5%、10%、20%、30%)丙烯酰胺的分離效果。隨著紅糖水溶液濃度的增加，丙烯酰胺色譜峰逐漸明顯，當紅糖濃度為20%，能明顯看到丙烯酰胺峰，繼續提高紅糖濃度至30%時，基線漂移較大，紅糖中雜質對丙烯酰胺峰造成了干擾，同時紅糖溶液的粘性增加，可能使色譜柱堵塞的幾率增大，從而可能降低色譜柱的使用壽命，故選擇20%紅糖溶液作為紅糖中丙烯酰胺檢測的最佳濃度。

2.2 方法評價

2.2.1 線性關系與最低檢出限

圖3 9號紅糖樣品溶液的濃度對分離效果的影響

將濃度為0.01～0.16 μg/mL的丙烯酰胺標準品溶液分別進樣，采用HPLC進行分析。相同質量濃度重復進樣3次，取3次進樣的平均峰面積(y，mAU)及標準品濃度(x，μg/mL)進行線性回歸。丙烯酰胺在0.01～0.16 μg/mL范圍內峰面積和質量濃度呈良好的線性關系，線性回歸方程為y=0.5224x+0.0020(r2=0.9991)，如圖4所示。

圖4 丙烯酰胺標準曲線圖

檢出限是衡量儀器或方法靈敏度的指標，定性檢出限(LOD)是在色譜圖上可以清楚確認地分析目的物色譜峰的下限，通常為噪音的3倍，定量檢出限(LOQ)指樣品按照分析方法的要求進行提取處理并檢測，能區分于噪聲的最低檢出濃度，通常為噪音的10倍。分別取3倍信噪比和10倍信噪比計算該方法的檢出限(LOD)為 0.003 μg/mL和定量限(LOQ)為 0.01 μg/mL。丙烯酰胺標準品溶液色譜圖見圖5。

2.2.2 樣品加標回收率和精密度

方法的準確度由加標回收率進行評定。取實驗配制的等體積的9號紅糖樣品溶液3份，分別添加體積分數低、中、高3個水平(0.018、0.042和0.064 μg/mL)的標準品溶液，進行HPLC分析，測定丙烯酰胺的保留時間和峰面積，計算丙烯酰胺的加標回收率。日內精密度和日間精密度用于評估方法的重復性和重現性。日內精密度為在一天內平行測定 5次樣品，而日間精密度為連續3天進行精密度實驗，結果以峰面積的相對標準差(RSD)表示。如表1所示，丙烯酰胺在低、中、高的平均回收率分別為93.4%、86.4%和 92.0%，方法的平均日內精密度為 1.06%、3.29%、2.69%，平均日間精密度為 3.86%、2.34%、4.40%，說明本方法的隨機誤差較小，因而可以滿足定量分析。

圖5 丙烯酰胺標準品高效液相色譜圖

表1 9號紅糖樣品中丙烯酰胺的加標回收實驗結果

2.2.3 樣品分析及含量測定結果

經過條件優化后獲得了最優HPLC分析條件：以 Hypercarb多孔石墨碳液相色譜柱(4.6 mm×100 mm，3 μm)進行分離；流動相∶甲醇-去離子水(15∶85，V/V)；流動相流速為1.0 mL/min；檢測波長為210 nm，柱溫35℃。圖6為其中一個紅糖樣品的色譜圖。

圖6 紅糖樣品高效液相色譜圖

對市售的10個紅糖樣品按1.3.2節步驟進行預處理，并采用優化后的檢測方法進行分析，將這些樣品的色譜圖和丙烯酰胺標準品色譜圖進行比較，樣品在2.4 min附近均有色譜峰出現，表明這些市售紅糖樣品均含有丙烯酰胺，詳見表2。樣品全部檢出丙烯酰胺，檢出濃度范圍為 243.67～1739.33 μg/kg，最高含量達1739.33 μg/kg，平均含量為806.52μg/kg。目前國內對紅糖中丙烯酰胺的含量并沒有相關政策進行約束，但歐盟自2017年便已實施關于丙烯酰胺的相關法規[23]。該法規所規定的大部分食品中的丙烯酰胺都必須低于500 μg/kg，兒童食品更是低至 40 μg/kg，結合本研究結果，過半樣品的丙烯酰胺含量都超過500 μg/kg，因此精確定量并控制紅糖中丙烯酰胺的含量是十分重要的，過量丙烯酰胺對食品安全存在的風險的影響應當引起國家監管部門及生產企業的重視。

表2 各紅糖樣品中丙烯酰胺的含量

3 結論

本實驗建立了紅糖中丙烯酰胺的高效液相色譜檢測方法，該方法為高水溶性食品中丙烯酰胺的分離檢測提供了指導。運用該方法丙烯酰胺實現了快速高效的分離，樣品加標回收率為 86.4%～93.4%，日內精密度在 1.06%～3.29%，日間精密度在2.34%～4.40%。該方法定性檢出限為0.003 μg/mL，定量限為0.01 μg/mL。本方法操作簡便，無需固相萃取，簡化了樣品預處理操作步驟；與目前廣泛運用的檢測方法相比，本方法大幅降低了檢測成本；對所需液相色譜儀器的要求較低，可在大多數實驗室中進行，具有較好的推廣價值。