液體接觸法與氣相接觸法對單離香料抗菌作用的影響

林雅慧 ，蘇俊婷，陳海寧*，陶 平，劉學文

1廣東省科學院生物工程研究所；2中國輕工業甘蔗制糖工程技術研究中心，廣州 510316

單離香料(isolate spices)是指通過物理或化學方法從植物精油中分離提純的單體化合物，如肉桂醛、香芹酚、月桂烯、檸檬醛、水楊醛、丁香酚、百里香酚、茴香腦等，從植物精油及單離香料中探索抗菌活性物質，成為國內外研發新型抗菌劑的一大熱點[1-4]。全國正處于被新型冠狀病毒圍困之際，人民對物品、空氣消毒的要求提升到了最高水平，75%乙醇、紫外線照射、過氧乙酸、過氧化氫、普通含氯消毒劑噴霧(灑)消毒這些方法都會對人體有不同程度的刺激，甚至對物品、用具造成腐蝕性損害，利用植物精油及其單離成分開發安全、高效、綠色的消毒劑具有巨大的市場前景。最常用的體外抗菌試驗采用菌體與抗菌物質直接接觸的方法，例如瓊脂擴散法、濾紙片法和稀釋法等，擴散法是通過抑菌圈直徑大小來衡量抗菌物質的抗菌活性及細菌對其的敏感程度；稀釋法是將抗菌物質加入肉湯/固體培養基測定精油的最小抑菌濃度MIC(minimum inhibitory concentrations)和最小殺菌濃度MBC(minimum bactericidal concentrations)以及殺菌時間[5-7]。氣相抗菌法是利用抗菌物質易揮發的特性，形成一定濃度的空間氛圍與微生物接觸，通過保持、移除抗菌成分氣相氛圍來測定MIC值與MBC值[3]。但目前對植物精油及單離香料氣相抗菌作用、抗菌測試方法對抗菌效果影響以及抗菌機制差異的研究較少。

本文選取《GB 2760-2014 食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》食品中允許添加的合成香料：芳樟醇、肉桂醛、水楊醛、檸檬醛、丁香酚和百里香酚，采用液體接觸抗菌法、氣相抗菌法分別測定6種單離香料對7種食源性致病菌的抗菌效果，根據單離香料的溶解性、揮發性對引起抗菌效果差異的因素進行討論，旨在全面評估6種單離香料的抗菌效果，為單離香料深入開發新型防腐抗菌劑，拓寬應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 單離香料

芳樟醇(98%，CAS 78-70-6)；肉桂醛(>95%，CAS 104-55-2)；水楊醛(98%，CAS 90-02-8)；檸檬醛(97%順式+反式，CAS 5392-40-5)；丁香酚(99%，CAS 97-53-0)；百里香酚(98%，CAS 89-83-8)購于阿拉丁試劑公司。

1.1.2 供試菌種

包括4種革蘭氏陰性菌(GN)和3種革蘭氏陽性菌(GP)，其中蠟樣芽胞桿菌(BacilluscereusATCC 11077)、單核增生李斯特氏菌(ListeriamonocytogenATCC 19115)、沙門氏菌(SalmonellaATCC 14028)、大腸埃希氏菌(EscherichiacoliATCC 25922)、副溶血性弧菌(VibrioparahaemolyticusATCC 17802)購于美國菌種保藏中心，金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusCMCC 26003)、志賀氏菌(ShigellaCMCC 51572)購于中國醫學細菌保藏管理中心。

1.1.3 培養基及試劑

磷酸鹽緩沖液(PBS)、腦心浸出液肉湯、營養肉湯、緩沖蛋白胨水、3%氯化鈉堿性蛋白胨水、胰蛋白胨大豆瓊脂、3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂購于北京陸橋技術股份有限公司。丙二醇、吐溫-80購于成都科龍化學試劑廠。

1.1.4 儀器設備

SQ810C高壓滅菌鍋(雅馬拓科技有限公司)；AC2-6S1生物安全柜(新加坡藝思高科技有限公司)；PHY-330H生化培養箱(寧波萊福科技有限公司)；比濁計(法國生物梅里埃公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌懸液的配制

取菌種接種于合適的肉湯(BHI肉湯或3%氯化鈉堿性蛋白胨水)活化16 h，4 ℃ 6 000 rpm離心5 min，用無菌PBS緩沖液洗滌2次，制得1麥氏單位(108～109CFU/mL)的菌懸液。

1.2.2 單離香料的配制

用丙二醇配制體積分數10%、25%、50%的單離香料稀釋溶液，裝于棕色試劑瓶中，存于4 ℃冰箱備用。

1.2.3 液體接觸法

本文采用雙倍稀釋法，分別吸取不同濃度單離香料溶液一定量分別加入裝有含0.1%吐溫-80等量營養肉湯的試管中，使營養肉湯含單離香料濃度為0.125、0.25、0.50、1.0、2.0、4.0、8.0 μL/mL，置培養箱中37 ℃下培養24 h，觀察生長情況，取沒有變渾濁的培養液在平板上劃線，置培養箱中37 ℃下培養24 h，觀察生長情況。培養液不變渾濁的最小濃度為該單離香料的最小抑菌濃度(MIC)，取該管培養液涂布仍不長菌最小濃度為最小殺菌濃度(MBC)。本實驗中單離香料濃度為8 μL/mL仍不能抑制微生物生長視為該單離香料對其無抗菌作用。實驗設3組平行。

1.2.4 氣相抗菌法

參考Lopez的氣相揮發試驗[3]。含定量凝固培養基的平皿上加入100 μL 108～109CFU/mL的菌懸液，用無菌的涂抹棒涂抹均勻。待菌液被吸收后倒置放置。取上述稀釋的單離香料，均勻滴在無菌濾紙圈上，置于皿蓋內側中心形成氣相氛圍(空間單離香料濃度為0.125、0.25、0.50、1.0、2.0、4.0、8.0 μL/mL)，取等量的丙二醇作為對照，另設一空白組。抑菌實驗直接將此培養皿蓋好用封口膜密封；37 ℃培養24 h，觀察記錄菌體在培養皿的生長情況。殺菌實驗取抑菌實驗中無菌生長的平板，在無菌環境更換培養皿蓋，用封口膜密封，于37 ℃培養24 h后觀察實驗結果。如果將氣相氛圍移除，細菌開始生長，則該濃度為最小抑菌濃度(MIC)；而仍然沒有細菌生長則說明細菌被殺滅，該濃度就是最小殺菌濃度(MBC)。實驗設3組平行。

1.3 數據分析

采用WPS軟件進行數據計算及圖表制作。MIC/MBC值經對數轉換后，不同接觸方式對單離香料對MIC/MBC值影響采用SPSS 19.0軟件重復測量方差分析方法，不同單離香料對MIC/MBC值影響、液體接觸法 MIC/MBC值比較采用秩和檢驗，統計結果P<0.05表示有統計學意義。

2 結果

2.1 芳樟醇對食源性致病菌的抗菌作用

作者通過實驗發現芳樟油對呼吸道致病菌有顯著的抗菌作用[8]，芳樟油中含84%～94%的芳樟醇，芳樟醇對常見食源致病菌的抗菌作用如表1。

表1 芳樟醇對常見食源性致病菌2種測試方法的MIC值、MBC值

液體接觸法實驗中志賀氏菌和單增李斯特菌對芳樟醇最敏感(MIC值為0.25 μL/mL)，其次是副溶血性弧菌、大腸埃希氏菌、蠟樣芽孢桿菌(MIC值為0.5 μL/mL)，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的敏感性較弱(MIC值分別為1、2 μL/mL)，芳樟醇對供試菌的抑制作用較明顯，殺滅作用則需要增加3倍MIC值。氣相抗菌試驗中MIC值等于MBC值，其中對副溶血性弧菌、志賀氏菌、單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌的MIC值為0.25、1 μL/mL空間濃度時可以殺滅全部供試食源性致病菌。

2種作用方式比較，芳樟醇氣相抗菌作用優于液體接觸抗菌作用，氣相濃度1 μL/mL時可以殺滅全部供試食源性致病菌，而液體接觸法需要4 μL/mL。

2.2 肉桂醛對食源性致病菌的抗菌作用

肉桂醛是肉桂精油的主要成分，肉桂醛的抗菌作用如表2。

表2 肉桂醛對常見食源性致病菌2種測試方法的MIC值、MBC值

液體接觸法肉桂醛體積濃度為0.5 μL/mL能對所有供試微生物起抑菌作用，對4種革蘭氏陰性菌起殺菌作用。肉桂醛在液體接觸法對革蘭氏陰性菌的殺菌濃度與抑菌濃度相近，對革蘭氏陽性菌的殺菌濃度與抑制濃度相差較大，為1～3倍。氣相抗菌法對3種革蘭氏陽性菌抗菌作用優于4種革蘭氏陰性菌，對金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特菌的MIC/MBC值為0.5 μL/mL，對志賀氏菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌、副溶血性弧菌MIC/MBC值為1 μL/mL。

肉桂醛對供試革蘭氏陰性菌的抗菌作用，液體抗菌法優于氣相法；對革蘭氏陽性菌的抗菌作用，氣相法優于直接接觸法。

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2.3 水楊醛對食源性致病菌的抗菌作用

水楊醛學名為鄰羥基苯甲醛，是苯甲醛的最重要的衍生物之一。低濃度的水楊醛除具有一定的香味外，還具有很強的抗菌能力，常作為防腐劑用于香精和香料中。Sun等[9]對30種芳香醛類進行防腐抑菌測試，發現絕大多數芳香醛類食用香料有較強的抑菌活性，其中水楊醛、苯丙醛、肉桂醛、2-呋喃丙烯醛對供試菌的抑菌效果最明顯。

如表3所示，2種測試方法中水楊醛的抑菌效果良好，0.125 μL/mL即可抑制所有供試菌，氣相法的效果更優，0.125 μL/mL空間濃度即可殺滅7種供試菌。

表3 水楊醛對常見食源性致病菌2種測試方法的MIC值、MBC值

2.4 檸檬醛對食源性致病菌的抗菌作用

檸檬醛是山蒼子油、檸檬油的主要成分，對大腸埃希氏菌、單增李斯特菌、尖孢鐮刀菌等均有顯著的抑菌活性[10]。

如表3所示，液體接觸法中，0.5 μL/mL檸檬醛對其他供試微生物都可起抑制作用，對沙門氏菌敏感程度最低，2 μL/mL可以殺滅除沙門氏菌的其他6種供試菌。氣相抗菌法顯示檸檬醛對革蘭氏陽性菌的抗菌效果優于革蘭氏陰性菌，0.5 μL/mL即可殺滅所有供試革蘭氏陽性菌，而對革蘭氏陰性菌的抗菌效果各異，MIC值從小到大排列：副溶血性弧菌<沙門氏菌、志賀氏菌<大腸埃希氏菌。綜合來說，檸檬醛的液體接觸抑菌效果優于氣相法，殺菌效果較氣相法弱。

表4 檸檬醛對常見食源性致病菌2種測試方法的MIC值、MBC值

2.5 丁香酚對食源性致病菌的抗菌作用

丁香酚在丁香精油中含量最高(80%以上)，對多種菌株具有強效的抗菌活性，比如革蘭氏陽性菌(蠟樣芽胞桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌、釀膿鏈球、糞腸球菌、單核細胞增生李斯特氏菌)和革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、傷寒沙門氏菌、霍亂沙門氏菌、銅綠假單胞菌，幽門螺桿菌，小腸結腸炎耶爾森菌、變形桿菌)[11,12]。

如表5所示，液體接觸抗菌中丁香酚對志賀氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的MIC值最低為0.25 μL/mL，對沙門氏菌、大腸埃希氏菌的MIC值為0.5 μL/mL，對蠟樣芽孢桿菌和副溶血性弧菌的抗菌效果較弱，MIC值分別為1、2 μL/mL。氣相抗菌法丁香酚在供試濃度范圍內(8 μL/mL)僅對副溶血性弧菌有抗菌作用，對其他6種試驗菌無抗菌效果。這與López等[13]的研究相似，丁香油在瓊脂稀釋法中對大腸桿菌較強，但氣相熏蒸試驗抗菌效果較差。

表5 丁香酚對常見食源性致病菌2種測試方法的MIC值、MBC值

2.6 百里香酚對食源性致病菌的抗菌作用

百里香酚是疏水物質，能與蛋白質的疏水區結合并溶解在脂相發生抗菌作用，百里香酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及霉菌、酵母菌都有較好的抑菌活性[14,15]。

如表6所示，百里香酚具有優異的抗菌能力，氣相抗菌優于直接接觸抗菌效果，0.125 μL/mL空間濃度可以殺滅7種供試菌，相同濃度下直接接觸法可以抑制7種供試菌，但對大腸埃希氏菌的MBC值為1 μL/mL，在供試濃度范圍內(8 μL/mL)都未能殺滅蠟樣芽孢桿菌。

表6 百里香酚對常見食源性致病菌2種測試方法的MIC值、MBC值

2.7 液體接觸法與氣相法顯著性差異分析

2種接觸方式的MIC/MBC值經對數轉換后，采用重復測量方差分析比較2種接觸方式對不同單離香料lg MIC值、lg MBC值的影響：通過圖1 lg MIC值變化可以看出接觸方式對肉桂醛、丁香酚對微生物的抑菌作用存在顯著差異(P<0.05)，液體接觸效果優于氣相法(P=0.002)。

圖1 接觸方式對單離香料抑菌作用的影響

圖2通過lg MBC值變化可以看出接觸方式對芳樟醇、水楊醛、丁香酚、百里香酚殺菌作用有顯著影響(P<0.05)，其中芳樟醇、水楊醛和百里香酚氣相法效果優于液體接觸法(P=0.042)。

圖2 接觸方式對單離香料殺菌作用的影響

對液體接觸法中MIC值與MBC值進行秩和檢驗Wilcoxon(W)檢驗，結果如表7：液體接觸法中的MIC值與MBC值存在顯著性差異，P<0.05，MBC均值是MIC均值的4倍。

表7 液體接觸法中MIC值與MBC值的秩和檢驗

2.8 不同單離香料抑菌作用、殺菌作用顯著性差異分析

不同單離香料的MIC/MBC值非參數檢驗Friedman(F)檢驗比較均有顯著性差異，MIC(卡方=58.802，P<0.05)，MBC(卡方=36.293，P<0.05)。幾種單離香料的MIC值經過Bonferroni校正后，水楊醛與百里香酚的抑菌作用顯著優于其他香料(P<0.05)；幾種單離香料的MBC值經過Bonferroni校正后，百里香酚的殺菌作用顯著優于芳樟醇、檸檬醛和丁香酚(P<0.05)，水楊醛的殺菌作用顯著優于丁香酚(P<0.05)。

3 討論與結論

目前學界認為植物精油及其單離成分抗菌機理是疏水性和分子小的精油穿過細胞膜和線粒體膜特殊的脂質結構使菌體結構破壞，導致(1)細胞壁結構的降解；(2)細胞膜損傷；(3)膜蛋白損傷；(4)胞內成分的外流；(5)細胞質成分凝固；(6)消耗質子流等，進而導致菌體死亡。上述列出的幾種機制并不是都獨立作用的，它們可能會相互影響，一種機制的反應也可能會受到另一種反應物或者生成物的影響[7,8,12]。比較2種接觸方式對常見食源致病菌的影響，單離香料抗菌能力會因與菌體作用的方式而異，芳樟醇、水楊醛、百里香酚的氣相抗菌效果優于液體接觸法，而丁香酚液體接觸抗菌效果優異但氣相抗菌效果不顯著。不同單離香料與菌體的接觸方式，對其抗菌機理的差異有待進一步研究。

有學者用直接接觸法測定精油組分抗菌活性，抗菌效果排序如下：酚類(活性最高)>肉桂醛>醇類>醛類=酮類>酯類>碳氫化合物類[16]。Knbloch等[17]對植物芳香精油的抗菌性能的研究提出精油在水相中的溶解度與有效成份透過細胞壁進入菌體的能力直接相關，而抗菌能力則與抗菌劑在菌體細胞膜雙磷脂層中溶解度有關的觀點。本文結合溶解性和揮發性來討論影響單離香料在這2種測試方法中抗菌活性：芳樟醇等6種供試單離香料均為親脂性物質，直接接觸法中單離香料需溶于水后嵌入脂肪酰基鏈之間進而改變膜脂質的組成，達到擾亂細胞膜結構影響其功能來達到抗菌效果。因此直接接觸抗菌能力與單離香料的溶解性有關，溶解性越大，說明其親水性越強，直接接觸抗菌作用更明顯。表8是www.chemspider.com檢索的單離香料部分物化參數，從中可以看出酚類物質百里香酚的溶解度大于丁香酚，醛類物質中溶解度從大到小依次為水楊醛、肉桂醛、檸檬醛。這與本文液體接觸抗菌效果完全吻合，酚類物質中百里香酚的抗菌作用大于丁香酚，醛類物質抗菌作用由強到弱依次為水楊醛、肉桂醛、檸檬醛。

表8 單離香料的物化參數

氣相抗菌是通過單離香料揮發到空間與培養基表面的菌體接觸進而發揮抗菌作用，因此抗菌能力還與氣體揮發性及其在瓊脂層的溶解度有關。如果單離香料揮發性強，相對親水性弱，瓊脂層對單離香料的吸收少，所形成的氣相精油濃度大且穩定，氣相抗菌效果較好；相反地單離香料揮發性弱，相對親水性強，所形成的氣相氛圍濃度較低，氣相抗菌效果較差。表7用蒸氣壓代表單離香料的揮發性，親疏水性質以log P(辛醇/水分配系數)表示，值越大，說明該物質越親油，反之，則越親水，即水溶性越好。從表7可以看出揮發性由強至弱：百里香酚>水楊醛>檸檬醛>芳樟醇>肉桂醛>丁香酚；相對親水性最強的是肉桂醛>丁香酚>芳樟醇>檸檬醛>百里香酚>水楊醛。這與本文試驗結果吻合：氣相抗菌效果最佳為水楊醛、百里香酚>芳樟醇>肉桂醛>檸檬醛>丁香酚。酚類物質中百里香酚的揮發性比丁香酚強，丁香酚的相對親水性強于百里香酚，因此百里香酚的效果遠比丁香酚效果好；醛類物質中，揮發性強弱依次為水楊醛>檸檬醛>肉桂醛，相對親水性依次為肉桂醛>檸檬醛>水楊醛，因此氣相抗菌效果最佳的為水楊醛>檸檬醛>肉桂醛。Inouye[18]在研究植物精油及其單離成分氣相抗菌活性時發現：抗菌活性與瓊脂層對揮發性物質的吸收、其親水性、揮發性和穩定性有關。López等[13,19]也發現類似的發現，在瓊脂稀釋法中肉桂和丁香油對大腸桿菌的抑制作用相似。但氣相熏蒸試驗肉桂油的抑菌作用比丁香油強，瓊脂稀釋法抑菌活性的大小取決于融入到瓊脂中的精油化合物的擴散性和溶解度，而氣相抗菌則與揮發性物質(包括親水性和親脂性物質)在空間與被瓊脂層吸收的部分水溶性物質之間的平衡有關。

利用植物精油及單離香料的抗菌性能開發新型抗菌劑，有利于林業產品的高值化利用，開發應用時需根據各種使用狀態的全面評估抗菌性能，根據使用狀態選擇合適的植物精油/單離香料。目前大部分植物精油及單離香料的抗菌研究僅從直接接觸方面考慮，如果將直接接觸法的抗菌結果應用在空間消毒，結果會相去甚遠。利用植物精油及單離香料的氣相抗菌作用開發食品氣調保藏、空氣殺菌劑具有廣闊的前景。本文的實驗結果將為開發單離香料天然氣態抗菌劑奠定研究基礎。