基于網絡藥理學研究楊桃根防治糖尿病腎病的作用機制

張宏亮，蔣 霞，黃天敏，丘 岳，黃光明，黃仁彬，黃振光

廣西醫科大學第一附屬醫院藥學部，南寧 530021

糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病的主要并發癥之一，亦是發達國家和地區終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的首要原因[1]。目前對于DKD，尚缺乏特異性的治療藥物。臨床上主要通過控制血糖、血壓、血脂、尿酸以及使用腎素-血管緊張素系統抑制劑、改善腎臟微循環藥物等延緩DKD進展[2]。

中草藥由于其多組分、多途徑、多靶點的優勢，在復雜疾病的防治方面顯示了良好的效果。我們前期開展了若干抗DKD中草藥及其活性成分的研究，發現酢漿草科屬植物楊桃根(the root ofAverrhoacarambolaL.，RAC)在防治DKD方面顯示了良好的優勢[3]，但作用機制不明。網絡藥理學是基于整體性與系統性的一種研究方法，將藥物-靶點與生物信息網絡相結合，類似于中醫提出的整體、辨證的觀點[4]。基于此，我們將采用網絡藥理學方法，構建楊桃根主要成分與DKD共有靶點，探討楊桃根防治DKD的潛在作用機制。

1 研究方法

1.1 楊桃根有效成分篩選

根據我們課題組前期關于楊桃根物質基礎的研究結果[5,6]，結合查詢關于楊桃根成分的文獻，建立成分庫。通過PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/)和Chemspider數據庫(http://www.chemspider.com/Default.aspx)，查詢已鑒定的成分的Canonical SMILES 字符串。

1.2 靶點篩選

楊桃根成分的靶點預測采用Swiss Target Prediction數據庫( http://www.swisstargetprediction.ch/)。該數據庫通過2D和3D結構相似性的特點，間接預測化合物的作用靶點[7]。具體操作為，將上一步查詢到的Canonical SMILES字符串輸入Swiss TargetPrediction網站，從而獲得每一成分的潛在靶點。

DKD疾病靶點預測采用GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)。分別以“Diabetic Kidney Disease”，“Diabetic nephropathy”作為關鍵詞進行檢索，以相關性分數(Relevance score≥30)作為篩選條件，從而得到DKD相關靶點。

進一步，利用網絡平臺繪制韋恩圖(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，獲得楊桃根主要成分與DKD的共有基因靶點信息，即得到楊桃根防治DKD的潛在作用靶點。

1.3 活性成分-靶點網絡構建

參考目前發表的文獻，用Cytoscape 3.8.0軟件構建活性成分-靶點的可視化網絡，然后對該網絡進行拓撲分析獲得各節點的中心度值(degree)[8]。

1.4 靶點蛋白PPI網絡構建及關鍵靶點篩選

利用String11.0在線數據庫對靶點蛋白相互作用(protein protein interaction,PPI)進行分析。具體操作為，將靶點輸入String，物種選擇“Homo sapiens”，以得分>0.4作為篩選條件，得到PPI網絡圖。

進一步，將PPI數據導入Cytoscape軟件，利用Cytoscape的CytoHubba插件篩選hub gene。

1.5 GO和KEGG通路富集分析

利用WebGestalt在線數據庫對關鍵靶點進行GO和KEGG分析，以P≤0.05為臨界，獲取GO及KEGG信號通路結果。

1.6 動物實驗驗證

1.6.1 實驗動物

SPF級KM雄性小鼠60只，體重20±2 g，購自廣西醫科大學實驗動物中心，動物合格證號SCXK(桂)2015-0001。小鼠飼養條件為：溫度25±2 ℃，相對濕度50%±20%，光照/黑暗交替12/12h，且自由進食、飲水。

1.6.2 楊桃根有效成分提取

楊桃根藥材粉碎，加8倍量60%乙醇-水浸泡30 min，常壓下加熱回流提取3次，每次1 h，濾過合并提取液；減壓回收乙醇，即得楊桃根提取物。

1.6.3 動物建模及給藥干預

所有小鼠適應性喂養1周后，隨機地分為兩組，空白對照組及模型組。空白對照組給予水和普通飼料，模型組給予高糖高脂飼料。高糖高脂飼料配方見本課題組以前發表的文獻[3]。連續喂養4周后，禁食過夜，單次腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)110 mg/kg；當血糖維持在11.2～16.7 mmol/L時即為造模成功。

除10只空白對照組小鼠外，其余50只小鼠隨機分為5組(模型組，陽性對照組，楊桃根高、中、低劑量組)，每組各10只。

楊桃根提取物高、中、低劑量組(RAC-H、RAC-M、RAC-L)分別給予1.2、0.6、0.3 g/kg/d灌胃，并同時給予高糖高脂飼料。陽性對照組(GQ)給予格列喹酮溶液灌胃(10 mg/kg/d并同時給予高糖高脂飼料。模型組(DM)僅給予高糖高脂飼料，空白對照組(NC)僅給予蒸餾水灌胃。

1.6.4 樣品的采集和處理

連續干預4周后，小鼠隔夜禁食12 h，測量空腹血糖，取血檢測相關指標，并用Western blot法檢測相關蛋白的表達。

1.6.5 統計學分析

2 結果

2.1 活性成分篩選

根據我們課題組前期關于楊桃根物質基礎的研究結果，結合查詢關于楊桃根成分的文獻，目前楊桃根的主要成分有24個，根據結構信息查詢得到所有成分的Canonical SMILES字符串，結果見表1。

表1 楊桃根主要活性成分及Canonical SMILES字符串

續表1(Continued Tab.1)

2.2 活性成分治療疾病相關靶點的篩選

根據Swiss Target Prediction 網站對24個活性成份進行靶基因預測，共得到2 331個相關靶點，進一步排除重復靶點，共得到潛在靶點281個。整理“成分-靶點”對，然后導入Cytoscape 3.8.0，建立“成分-靶點”網絡，如圖1。由圖可知，該網絡共有663條邊，305個節點。305個節點中，24個紅色節點代表楊桃根的每一個成分，281個藍色節點代表與成分對應的靶點，即潛在相關靶點。

圖1 成分-潛在相關靶點網絡圖

2.3 DKD靶點預測結果

從Genecards數據庫中篩選得到14 329個DKD相關靶點，去除重復后得到662個潛在靶點。然后根據281個成分靶點與662個疾病靶點繪制韋恩圖(見圖2)，從而獲得DKD共性靶點基因59個。

圖2 楊桃根提取物成分與DKD靶點韋恩圖

2.4 疾病靶蛋白相互作用網絡構建

將DKD共性靶點基因導入STRING在線數據庫，查詢59個共性靶點的相互作用關系，進行可視化分析后獲得疾病靶蛋白相互作用(PPI)網絡(圖3)，其節點數為59，邊數為461，平均節點度為15.6。

圖3 楊桃根防治DKD潛在靶點的PPI網絡圖

2.5 關鍵靶點的篩選

將PPI數據導入Cytoscape軟件中，利用CytoHubba插件中的MCC算法篩選最重要的10個關鍵基因(圖4)。這些關鍵基因包括：基質金屬蛋白酶9(MMP9)、表皮生長因子受體(EGFR)、成纖維細胞生長因子2(FGF2)、信號轉導和轉錄激活子3(STAT3)、絲裂原激活的蛋白激酶1(MAPK1)、基質金屬肽酶2(MMP2)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、半胱天冬酶3(CASP3)、原癌基因Hras(HRAS)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。

圖4 CytoHubba篩選關鍵靶點的網絡圖

2.6 活性成分-關鍵靶點網絡分析

根據篩選得到的活性成分和10個關鍵靶點，利用Cytoscape軟件構建活性成分-靶點網絡圖，見圖5所示。由圖可知，該網絡共有節點24個，邊32條，其中14個節點代表楊桃根成分，用紅色標示，10個節點代表潛在關鍵靶點，用藍色標示。

圖5 楊桃根防治DKD活性成分-關鍵靶點網絡圖

2.7 靶點的 GO 生物功能注釋

GO富集分析主要包括生物過程(biological process，BP)、細胞組成(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)三部分。利用WebGestalt對10個關鍵靶基點進行GO生物功能注釋，并分別對前10個條目進行可視化分析，見圖6。圖中橫坐標為標準化富集分數，縱坐標表示富集條目。

圖6 楊桃根防治DKD關鍵靶點GO富集柱狀圖

在生物過程(BP)中，主要富集條目為：調控細胞遷移(positive regulation of cell migration)、調控細胞運動(positive regulation of cell motility)、調控細胞成分的運動(positive regulation of cellular component movement)、運動調控(positive regulation of locomotion)、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路(transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway)、酶聯受體蛋白信號通路(enzyme linked receptor protein signaling pathway)、細胞增殖調控(positive regulation of cell proliferation)等。

在細胞組成(CC)中，富集條目主要分布于：富含纖維膠凝蛋白的顆粒內腔(ficolin-1-rich granule lumen)、膜筏(membrane raft)、膜微區(membrane microdomain)、膜區(membrane region)、囊泡腔(vesicle lumen)等。

在分子功能(MF))中，富集條目主要分布于：趨化活性(chemoattractant activity)、磷脂酰肌醇-4,5-雙磷酸3-激酶活性(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase activity)、磷脂酰肌醇二磷酸激酶活性(phosphatidylinosital bisphosphate kinase activity)、磷脂酰肌醇3-激酶活性(phosphatidylinasitol 3-kinase activity)、金屬內肽酶活性(metalloendopeptidase activity)、磷酸酶結合(phasphatase binding)、細胞因子受體結合(cytokine receptor binding)、內肽酶活性(endopeptidase actirity)等。

2.8 KEGG通路富集分析

利用WebGestalt在線數據庫對10個關鍵靶基點進行KEGG富集分析，結果進行可視化分析，得到KEGG富集分析柱狀圖(見表2)。由表可知，關鍵靶點主要富集通路如下：蛋白聚糖與腫瘤(proteoglycans in cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、腫瘤相關microRNA(microRNAs in cancer)、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、癌癥通路(pathways in cancer)、糖尿病并發癥AGE-RAGE通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、松弛素信號通路(relaxin signaling pathway)、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染(kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、內分泌抵抗(endocrine resistance)、缺氧誘導因子信號通路(HIF-1 signaling pathway)。

表2 楊桃根防治DKD關鍵靶點的KEGG富集分析圖

續表2(Continued Tab.2)

2.9 動物實驗驗證結果

2.9.1 小鼠腎功能變化

胱抑素C(CysC)作為一種敏感性好、特異性高的標志物，可以在腎損傷早期做出準確的預測。在本研究中，模型組的CysC水平均明顯增加(P<0.05)；當給予不同劑量的楊桃根提取物干預后，各組的CysC水平均明顯下降，且呈劑量依賴性(P<0.05)。尤其是中、高劑量的DMDD，結果見圖7。

圖7 楊桃根對糖尿病小鼠腎功能的影響

2.9.2 Western blot檢測結果

Western blot結果如圖9所示，模型組的TGFβ1蛋白表達明顯上調，差異均具有統計學意義(P<0.05)；當給予楊桃根提取物預后，其表達水平均下調，且有劑量依賴趨勢。而TGFβ1與AGE-RAGE信號通路相關，提示AGE-RAGE信號通路在楊桃根提取物防治DKD的過程中發揮重要作用。

3 討論

DKD患病率高，心腦血管并發癥風險大，是糖尿病患者死亡的重要風險因素[9]。然而，由于DKD發生機制復雜，目前關于DKD的治療尚未取得突破性進展[10]。關于楊桃根治療DKD，我們課題組前期進行了大量的研究。發現楊桃根及其主要成分改善糖尿病及腎損害相關并發癥可能與調節糖代謝和脂代謝紊亂、胰島素抵抗以及氧化應激等有關[11]。

圖8 小鼠腎組織TGFβ1蛋白表達水平

進一步發現，其發生機制可能與TLR4/NF-κB、TGFβ/Smad2/3等多條信號通路相關[12]。然而，具體的作用機制尚待進一步闡明。

中藥具有成分復雜，藥理作用廣泛的特點。楊桃根發揮防治DKD作用，取決于哪些活性成分以及其對應的靶點是什么是我們關注的重點。我們課題組前期對楊桃根的有效成分進行了提取分離純化分析，共得到24個活性化合物。在這些化合物中，我們發現化合物2(楊桃根環己二酮)在DKD的防治過程中發揮了重要的作用，是潛在的主要活性成分[13]。然而其他成分是否在DKD的防治過程中發揮重要作用，還需進一步研究。通過網絡藥理學篩選，我們發現，除了楊桃根環己二酮之外，苦瓜苷C、櫻桃素、胡蘿卜甾醇等成分亦與多個DKD關鍵靶點相關。提示我們，這些成分在DKD的防治過程也發揮了重要的作用，有待我們后續的進一步驗證。

關鍵靶點篩選方面，我們篩選出了10個關鍵靶標，分別為：基質金屬蛋白酶9(MMP9)、基質金屬肽酶2(MMP2)、表皮生長因子受體(EGFR)、成纖維細胞生長因子2(FGF2)、信號轉導和轉錄激活子3(STAT3)、絲裂原激活的蛋白激酶1(MAPK1)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、半胱天冬酶3(CASP3)、原癌基因Hras(HRAS)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。在這10個關鍵靶標中，MMP2和MMP9為基質金屬蛋白酶的重要成員，作用底物主要為細胞外基質(ECM)的Ⅳ型膠原，其功能與降解和重構細胞外基質(ECM)動態平衡密切相關[14]。DKD患者早期有腎小球基底膜和腎小球系膜區ECM累積的臨床表現，MMP9和MMP2及其組織抑制因子(TIMPs)在ECM降解過程中發揮非常重要的作用[15]。此外，MMP9結合CD44可釋放儲存的TGF-β1[16]，MMP9亦可通過釋放血管內皮生長因子(VEGF)以參與血管生成[17]。

KEGG富集分析顯示關鍵靶點主要富集于蛋白聚糖與腫瘤、膀胱癌、腫瘤相關MicroRNA、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、癌癥通路、糖尿病并發癥中AGE-RAGE信號通路、松弛素(屬于胰島素家族)信號通路、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染、內分泌抵抗、缺氧誘導因子相關信號通路上。在這些信號通路中，AGE-RAGE信號通路、松弛素信號通路、內分泌抵抗、缺氧誘導因子等均與糖尿病的發生和發展密切相關。

晚期糖基化終末產物(AGEs)-糖基化終末產物受體(RAGEs)信號通路是糖尿病腎病發生發展的重要環節。在DKD的發生和發展過程中，AGE-RAGE主要通過激活NF-κB，引起大量黏附分子、生長因子、促炎細胞因子等的表達和釋放，最終引起慢性細胞活化和組織損傷。我們前期研究也發現，楊桃根提取物DMDD可以通過抑制NF-κB的激活，從而減輕一系列的炎癥損傷來達到防治糖尿病的相關并發癥的作用[12]。AGE-RAGE還可刺激VEGF的表達，從而增加血管的通透性，導致蛋白尿的發生。另AGE-RAGE還可刺激TGF-β1的產生，誘導單核細胞趨化蛋白MCP-1表達的增強來引起DKD的發生和發展[18]。我們通過動物實驗驗證了該信號通路，TGFβ1和NF-κB在糖尿病模型組的蛋白表達均明顯上調，當給予楊桃根提取物預后，它們的表達水平均下調，且有劑量依賴趨勢，提示AGE-RAGE信號通路在楊桃根提取物防治DKD的過程中發揮重要作用。

綜上，本研究運用網絡藥理學的方法，篩選出了楊桃根發揮藥理作用的的主要活性成分包括楊桃根環己二酮、苦瓜苷C、櫻桃素和胡蘿卜甾醇等。這些活性成分主要通過MMP9、MMP2、EGFR、FGF2、STAT3、MAPK1、VEGFA和CASP3等關鍵靶點，參與AGE-RAGE信號通路、Relaxin信號通路、胰島素抵抗信號通路和缺氧誘導因子信號通路發揮防治DKD的作用。通過本研究，初步闡明了楊桃根的主要藥效成分及其作用靶點和相關通路在DKD防治中的作用。這些研究不僅與我們課題組的前期研究相互驗證，還為更多后續的研究提供了思路和方向。