虎杖苷通過激活TrkA抑制芬太尼誘導的海馬神經元細胞凋亡

李佩佩，郝 鈺，楊 磊

1寧夏醫科大學總醫院麻醉科；2寧夏醫科大學總醫院心內科；3寧夏醫科大學總醫院中醫骨傷科，銀川 750004

盡管全身麻醉被認為是世界上數百萬診所每天都采用的安全且常規的醫療程序，但是近幾十年的研究發現，在某些情況下，全身麻醉可能會導致中樞神經系統嚴重和不可逆轉的神經損傷，尤其是在年輕和嬰兒患者中[1]。在幾種廣泛使用的麻醉藥中，芬太尼被證實在動物模型中可誘導神經元生長錐塌陷，神經突變性和其他組織病理學損害。近年來的研究指出，藥物或遺傳干預可以對芬太尼誘導的神經毒性發揮挽救作用，例如地塞米松可通過PI3K/Akt和ERK信號通路減輕芬太尼誘導的神經損傷[2,3]。

腦源性神經營養因子(BDNF)是由BDNF基因編碼的一種生物活性蛋白，屬于神經營養因子家族成員，集中分布于神經系統，通過與其高親和力原受體酪氨酸激酶受體(Trk)相結合從而調節其下游信號轉導通路發揮生物學效應，在中樞神經系統神經元及突觸的生長，成熟，分化以及存活等過程中發揮重要作用，并通過抑制神經元凋亡，改善神經元的病理狀態維持成熟神經元，發揮長時程增強作用，進而促進理解和記憶能力，此外BDNF/Trk還可通過與中腦邊緣葉的多巴胺能系統相互作用，調節多巴胺釋放,誘導多巴胺相關行為，改善或惡化認知和記憶功能。動物實驗指出，敲除受體酪氨酸激酶受體基因的小鼠長時程增強顯著受損，理解和記憶能力顯著損傷[4-6]。虎杖苷為芪類有機化合物，是我國傳統中藥虎杖的干燥根莖中分離提取的天然活性成分之一，近年來的研究指出虎杖苷可以通過增加自由基清除或誘導淀粉β蛋白降解來預防神經退行性疾病，包括帕斯病或阿爾茨海默氏病[7,8]，但是，目前虎杖苷是否在麻醉誘導的中樞神經系統毒性中發揮神經調節功能性作用尚不清楚，因此，我們通過使用虎杖苷預處理海馬神經元細胞，以檢測虎杖苷對芬太尼麻醉后的神經保護功能及其潛在機制。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

聚D賴氨酸、10%胎牛血清、青霉素鏈霉素、DMEM培養基、成像載玻片(Thermo Fisher Scientific，美國)；玻璃蓋玻片、12孔板(CST，美國)；虎杖苷和芬太尼(Sigma Aldrich，美國)；TrkA封閉抗體、非特異性IgG抗體(Creative Biolabs，美國)；RBFOX3/NeuN抗體(Novus，美國)；Click-iT TUNEL Alexa Fluor 468成像分析儀，TRIzolTMPlus RNA純化試劑盒，抗TrkA、TrkB、TrkC兔多克隆抗體，抗磷酸化TrkA、TrkB、TrkC兔多克隆抗體，抗cleaved-Caspase-9抗體，ECL Plus試劑(Invitrogen，美國)；Caspase-9抗體(Abcam，中國)；Axiovert顯微鏡(Zeiss，德國)；逆轉錄試劑盒(羅氏，美國)；SYBR Green Mix(TOYOBO，日本)；TrkA、TrkB和TrkC的引物(Sangon Biotech，中國)；RIPA裂解緩沖液、BCA試劑盒、SDS-PAGE凝膠、PVDF膜(Beyotime，中國)；ChemiDocTM觸摸成像系統(Bio-Rad，美國)；ImageJ軟件(NIH，美國)。

1.2 海馬神經元細胞的體外培養

從寧夏醫科大學實驗動物中心購買5周大的C57BL/6小鼠，飼養于大學動物試驗中心，環境溫度22～26 ℃，濕度45%～55%，自由飲食飲水，飼養一周后用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉并通過頸椎脫臼法迅速處死，無菌條件下快速提取小鼠海馬神經組織，將分離海馬神經元細胞接種在層粘連蛋白/聚D賴氨酸的玻璃蓋玻片的12孔板中，并在補充10%胎牛血清和青霉素鏈霉素的DMEM培養基中孵育，在5%CO2的濕潤組織培養箱中，37 ℃下培養。

1.3 藥物處理

虎杖苷(polydatin)和芬太尼(fentanyl)在DMSO中溶解，并在培養基中稀釋至工作濃度，NMAC13(TrkA封閉抗體)和非特異性IgG抗體于TBST中稀釋至工作濃度。

虎杖苷預處理組：將海馬神經元細胞培養物用濃度為(0.01、0.05、1、5、10、50、100 μM)的虎杖苷預處理12 h，除去虎杖苷后使用常規培養基培養12 h，使用5 mM芬太尼處理2 h后將培養基更換為常規培養基，孵育24 h；陰性對照組細胞使用5 mM 芬太尼處理海馬神經元細胞 2 h，將培養基更換為常規培養基，室溫孵育24 h；然后進行TUNEL、qRT-PCR和Western blot分析。

使用NMAC13(20 μg/mL，NMAC13組)或IgG(20 μg/mL，IgG對照組)處理海馬神經元細胞 24 h后用虎杖苷(50 μM)處理12 h，除去虎杖苷后使用常規培養基培養12 h，使用5 mM芬太尼處理2 h后將培養基更換為常規培養基，孵育24 h，然后進行TUNEL、qRT-PCR和Western blot分析。

1.4 TUNEL法檢測細胞凋亡

PBS洗滌三次后，鋪好至多聚賴氨酸載玻片上，4%多聚甲醛中固定25 min，室溫孵育過夜，根據制造商說明書，添加Alexa Fluor 647偶聯的RBFOX3/NeuN抗體，避光孵育45 min后，從12孔板中取出蓋玻片并置于成像載玻片上，使用Click-iT TUNEL Alexa Fluor 468成像分析儀評估海馬神經元細胞凋亡。

1.5 免疫組織化學染色

將獲取的小鼠海馬神經組織經固定、脫水、包埋、切片處理后，用二甲苯脫蠟并用梯度乙醇和蒸餾水處理，在沸騰的0.01 M檸檬酸鹽緩沖液中加熱90 s后將切片冷卻，與3%過氧化氫溫育10 min后與Caspase-9抗體(1∶1 000)室溫孵育2 h，加入Max Vision TM，HRP標記的小鼠二抗室溫孵育30 min，使用Axiovert顯微鏡觀察染色。

1.6 RNA提取和實時定量PCR(qRT-PCR)

使用TRIzol?Plus RNA純化試劑盒從海馬神經元細胞中提取總RNA，然后根據試劑商說明書使用逆轉錄試劑盒將其反轉錄為cDNA。使用SYBR Green Mix在C1000TM PCR儀上進行QRT-PCR。小鼠Tropomyosin受體激酶A、B和C(TrkA、TrkB和TrkC)的引物購自Sangon Biotech。以β-肌動蛋白為內參，根據2-ΔCtCt方法將基因表達標準化，引物序列見表1。

表1 PCR所用引物序列

1.7 蛋白質印跡分析

當細胞生長至對數生長期后胰酶消化收集細胞，根據制造商的說明書，使用RIPA裂解緩沖液從海馬神經元細胞培養物中提取總蛋白，并使用BCA試劑盒進行定量。對于每份樣品，將等量的蛋白質在SDS-PAGE凝膠上120 V，90 min電泳，然后室溫轉移到PVDF膜上。與相應一抗室溫孵育過夜，包括抗TrkA兔多克隆抗體(1∶500)，抗TrkB兔多克隆抗體(1∶500)，抗TrkC兔多克隆抗體(1∶500)，抗磷酸化TrkA兔多克隆抗體(1∶500)，抗磷酸化TrkB兔多克隆抗體(1∶500)和抗磷酸化TrkC兔多克隆抗體(1∶500)，抗Caspase-9抗體(1∶500)，然后在室溫下孵育HRP偶聯的二抗室溫孵育2 h。用ECL Plus試劑進一步增強印跡，并使用ChemiDocTM觸摸成像系統對其進行可視化。使用ImageJ軟件進行光密度分析。以β-肌動蛋白為內參進行蛋白表達的標準化。

1.8 動物實驗

莫里斯水迷宮：將直徑為120 cm，高度為50 cm的圓形罐放置在黑暗的測試室中，黑暗測試室內的水深高于平臺，圓形水箱分為四個相等的部分，分別設計用于北部，東部，南部和西部區域。將直徑為8 cm的黑色圓形平臺放置在恒定位置，該位置位于水箱的東北區域，其頂點在水平面以下1 cm，水用無毒的黑色染料染色，水下平臺的位置不可見。在所有實驗中，將動物從水箱的西南象限釋放，找到平臺后，讓小鼠在平臺上停留30 s，每只小鼠每天定期訓練4次，使其最終找到水下潛藏平臺的時間低于60 s。

隨機將訓練后的小鼠分為對照組和虎杖苷組，對照組腹腔注射芬太尼(5 mg/kg)，每三天一次，虎杖苷組腹腔注射芬太尼(5 mg/kg)和虎杖苷(10 mg/kg)進行聯合處理，每三天一次，持續處理兩周后進行莫里斯水迷宮測試以評估虎杖苷組和對照組小鼠的學習和記憶能力，視頻跟蹤系統記錄尋找逃生平臺的時間，找到隱藏平臺的時間作為學習能力指標，撤去水下平臺，記錄小鼠在1 min內越過原始平臺的時間和保留時間，以評估其學習和記憶功能。

1.9 統計分析

所有實驗均至少重復進行三次，所有數據均表示為平均值±標準誤差(SEM)。使用SPSS軟件17.0(SPSS，美國)對所有統計分析進行Studentt檢驗。P<0.05時，差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 虎杖苷抑制芬太尼誘導的海馬神經元細胞凋亡

與對照組相比，芬太尼處理后，細胞凋亡增加(圖1A)；與芬太尼相比，虎杖苷預處理可顯著降低芬太尼誘導的神經細胞凋亡(圖1A)，此外在50 μM處虎杖苷處理顯示出最大的神經元凋亡抑制作用，故后續選擇此劑量。

圖1 虎杖苷對芬太尼誘導的海馬神經元細胞凋亡發揮保護作用

2.2 虎杖苷抑制Caspase-9表達

與對照組相比，芬太尼處理后，Caspase-9和cleaved-Caspase-9表達增加(P<0.05)；與芬太尼相比，虎杖苷預處理組Caspase-9與cleaved-Caspase-9表達降低(P<0.05，圖2)。

圖2 虎杖苷抑制芬太尼誘導的Caspase-9的表達

2.3 虎杖苷激活芬太尼處理后海馬神經元細胞中的TrkA與BDNF

與芬太尼相比，虎杖苷預處理組TrkA，TrkB或TrkC基因表達沒有顯著差異(圖2A，P>0.05)，BDNF轉錄水平顯著增加(圖2A，P<0.05)，TrkA，TrkB以及TrkC的蛋白表達也無顯著差異(圖2B～F，P> 0.05)，但BDNF和磷酸化TrkA的表達顯著增加(圖2B～C，2H～I，P<0.05)。

2.4 虎杖苷通過TrkA信號通路發揮神經保護作用

與IgG對照組相比，MNAC13組TrkA蛋白表達未受影響，但BDNF和磷酸化TrkA蛋白表達顯著降低(圖4A和4B，P>0.05)，細胞凋亡顯著增加(TUNEL陽性)(圖4C～D，P<0.05)。

圖4 虎杖苷通過TrkA信號通路發揮神經保護作用

2.5 虎杖苷改善小鼠學習和記憶能力

與對照組相比，芬太尼處理后，小鼠到達目標象限和穿越平臺的時間顯著增加，提示其學習記憶能力的下降(P<0.05，圖5A和5B)；與芬太尼相比，虎杖苷處理可顯著降低芬太尼誘導的學習記憶能力的下降(P<0.05，圖5A和5B)。

圖5 莫里斯水迷宮測試

3 結論

高濃度的全身麻醉藥(例如芬太尼)導致的麻醉持續狀態可能引起缺血性缺氧和水腫，并誘發興奮性氨基酸的釋放，鈉和鈣的流入以及Caspase蛋白家族的活化，而Caspase的表達增加進一步激活下游效應子，導致包括海馬神經元細胞在內的神經細胞凋亡，并誘發各種病理改變，例如神經元丟失和神經膠質細胞增生，導致中樞神經系統的急性和持續性損害，尤其是海馬和其他邊緣系統的神經元的損害，雖然少見，但可能對年輕和嬰兒患者的發育中的大腦造成嚴重和永久的損害[9-12]，因此研究麻醉誘導的中樞神經系統毒性的潛在機制以及其有效預防藥物具有重要的臨床意義，而我們的研究發現芬太尼處理可以顯著誘導神經元細胞凋亡，抑制TrkA的磷酸化激活，促進Caspase-9的表達，損傷小鼠學習和認知能力，而虎杖苷預處理可以逆轉芬太尼誘導的神經元凋亡和小鼠學習認知能力的損傷。

圖3 虎杖苷對芬太尼處理的海馬神經元細胞中TrkA /B/C與BDNF的作用

虎杖為蓼科多年生灌木狀草本植物，以干燥根莖和根入藥，虎杖中主要含有蒽醌類、黃酮類以及酚類化合物，具有有多種藥理作用，包括抗炎，抗病毒，抗菌，調血脂，抗血栓，心肌保護，抗氧化，抗腫瘤，神經保護的作用[13]。虎杖苷是從其干燥根莖部中提取而來的活性成分，研究表明虎杖苷具有良好神經保護作用，可以通過進GLI-1(膠質瘤相關癌基因蛋白1)和SOD1(超氧化物歧化酶)的表達，下調NF-κB(核因子κB)活性，改善血腦屏障，進而保護腦中動脈缺血對大腦造成的損傷，減輕學習記憶障礙，改善認知障礙[14,15]；在脊髓損傷的體內動物模型中，虎杖苷可通過增加超氧化物歧化酶，減少丙二醛和抑制凋亡相關信號通路而發揮神經保護作用[16-18]。最近研究發現，腦缺血后使用鞘氨醇處理可以通過激活Caspase-9/Caspase-3來促進海馬神經元的凋亡，導致學習記憶能力下降，損害學習和記憶能力，而虎杖苷可以通過神經營養信號通路保護皮質神經元免受缺血性損傷，并通過下調Caspase-9抑制Caspase-3(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3)的激活，抑制神經元細胞凋亡，發揮神經保護功能，進而改善小鼠的學習和記憶能力[19-22]。我們的研究結果顯示，虎杖苷可以顯著抑制芬太尼誘導的Caspase-9上調神經元細胞凋亡，發揮神經元保護作用，改善小鼠學習和記憶能力。

原肌球蛋白受體激酶(Trk)受體(包括TrkA、TrkB和TrkC)在海馬神經元發育過程中動態表達，通過與腦源性神經營養因子結合發生磷酸化，進而啟動相關信號通路，并與神經營養蛋白信號通路相互作用以調節海馬神經元的成熟，分化，存活，突觸重塑或損傷，研究指出，通過激活神經營養信號通路中的TrkA/B可以會降低麻醉誘導的神經毒性[23-25]，我們的研究發現，虎杖苷可以通過上調磷酸化激活的TrkA，顯著抑制芬太尼誘導的神經元細胞凋亡，發揮神經元保護作用。

總之，我們的結果表明虎杖苷可以通過抑制Caspase-9的上調，促進TrkA的磷酸化激活降低芬太尼誘導的海馬神經元細胞凋亡，發揮神經保護作用，改善小鼠學習和記憶能力。