N-乙酰半胱氨酸對PM2.5引起HaCaT細胞損傷的保護作用

李錦濯 林志鵬 曾倩雯 孫仁山

陸軍軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院皮膚科，重慶，400042

PM2.5是大氣懸浮顆粒物(particulate matter, PM)中的細顆粒物，空氣動力學直徑≤2.5 μm，其粒徑小，危害大，是空氣污染重要的監(jiān)測指標。隨著全球經(jīng)濟快速發(fā)展，空氣污染嚴重，PM2.5污染引發(fā)的健康問題也受到廣泛關(guān)注，我國于2012年制定了PM2.5的空氣質(zhì)量標準[1]。PM2.5可以長時間懸浮于空氣中，表面富集有多種有害物質(zhì)，其主要成分為：NH4+、SO42-、NO3-等無機鹽，多環(huán)芳烴等有機物，有機碳、無機碳等含碳組分，多種重金屬元素以及一些致病微生物[2]。

流行病學研究報道PM2.5可以影響呼吸系統(tǒng)[3]和心血管系統(tǒng)[4]疾病的發(fā)病率和死亡率。皮膚作為機體最大的器官，長期處于環(huán)境PM2.5中，PM2.5中含有脂溶性成分如多環(huán)芳烴等，容易滲透進入皮膚[5]。目前研究認為，PM2.5中的有毒物質(zhì)既可以直接經(jīng)皮吸收，也可以經(jīng)過呼吸系統(tǒng)進入人體后通過血液循環(huán)到達皮膚，進而誘導(dǎo)皮膚細胞氧化應(yīng)激，激活細胞內(nèi)多種炎癥信號通路，導(dǎo)致皮膚損傷[6]。角質(zhì)形成細胞在皮膚炎癥反應(yīng)的啟動與加重過程中發(fā)揮重要作用，與多種炎癥性皮膚病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本課題組前期發(fā)現(xiàn)PM2.5可降低HaCaT細胞存活率，促進細胞凋亡，且可能通過誘導(dǎo)NF-κB信號通路活化進而上調(diào)CCL20表達[7]，但PM2.5導(dǎo)致皮膚細胞損傷的具體機制以及如何進行防治尚不清楚。NAC作為一種高效的抗氧化劑，可以清除細胞內(nèi)活性氧自由基來降低氧化應(yīng)激狀態(tài)，通過研究NAC是否對PM2.5誘導(dǎo)的HaCaT細胞損傷發(fā)揮保護作用，探討氧化應(yīng)激在PM2.5誘導(dǎo)的HaCaT細胞損傷中可能的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo)、倒置顯微鏡(日本OLYMPUS IX70)、SpectraMax i3x多功能酶標儀(美國Molecular Devices)、CFX Connect real-time PCR儀(美國BIO-RAD)、ChemiDocTM Touch Imaging System化學發(fā)光成像儀(美國BIO-RAD)、NanoDrop2000超微量核酸蛋白測定儀(美國Thermo)等。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(SH30022美國Hyclone)、ROS試劑盒(S0033S上海碧云天)、CCK-8試劑盒(CK04日本同仁)、ELISA試劑盒(E-EL-H0149c H1598c H2402c武漢Elabscience)、NAC(S0077上海碧云天)、Phospho-NF-κB p65 Rabbit mAb(3033美國CST)、NF-κB p65 Rabbit mAb(8242美國CST)、重組Anti-GAPDH抗體(ab181602美國abcam)、RT-PCR引物(上海生工)、SYBR Green試劑盒(QPK-201日本toyobo)等。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5混懸液制備 PM2.5收集膜由重慶市生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心饋贈。將收集好PM2.5的濾膜剪成小塊，放入試管，加三蒸水，超聲震蕩5 h，收集震蕩液后過濾。濾液移至平皿，真空冷凍干燥48 h后收集絮狀產(chǎn)物，-20℃儲存。稱取適量顆粒物，超凈工作臺內(nèi)紫外照射30 min，用無菌PBS配成10 mg/mL的儲存液，4℃儲存。實驗前用培養(yǎng)液稀釋成不同濃度PM2.5混懸液(0～400 μg/mL)。

1.2.2 細胞培養(yǎng) HaCaT細胞由重慶市陸軍軍醫(yī)大學防原教研室饋贈。采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞，使用0.25%胰酶進行消化傳代。取對數(shù)生長期，穩(wěn)定生長的HaCaT細胞進行實驗。

1.2.3 實驗分組與NAC干預(yù) 實驗分組：對照組和實驗組。對照組：PM2.5濃度為：0 μg/mL。實驗組：不同濃度PM2.5刺激實驗：設(shè)五個PM2.5濃度：25、50、100、200、400 μg/mL。NAC干預(yù)實驗：PM2.5濃度為：200 μg/mL，NAC干預(yù)濃度：細胞增殖實驗為2.5、5、10 mmol/L，根據(jù)細胞增殖實驗結(jié)果，其余干預(yù)實驗NAC濃度均為5 mM。每組至少設(shè)三個平行孔。

NAC干預(yù)：NAC干預(yù)組用DMEM配制相應(yīng)濃度的NAC工作液預(yù)處理1 h，其余各組加同等劑量的DMEM。隨后NAC干預(yù)組及PM2.5組細胞再予以200 μg/mL濃度的PM2.5混懸液刺激24 h，對照組給予同等劑量的DMEM全培養(yǎng)液孵育24 h，再進行后繼實驗。

1.2.4 DCFH-DA探針法檢測ROS 選取對數(shù)生長期的HaCaT細胞，消化離心重懸后，細胞接種96孔板，待細胞融合至80%左右，棄培養(yǎng)基。根據(jù)1.2.3實驗分組，PM2.5染毒24 h，棄培養(yǎng)基。緩沖液洗滌，避光條件加入100 μL DCFH-DA(濃度：10 μmol/L)，在37℃下CO2培養(yǎng)箱中孵育20 min。緩沖液沖洗3次，采用多功能酶標儀檢測熒光強度。以實驗組與對照組熒光值之比表示ROS相對水平。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞存活率 細胞接種96孔板，PM2.5染毒24 h后，棄培養(yǎng)基。PBS洗滌3次，加100 μL含l0%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基及10 μL CCK-8檢測試劑，孵育2 h。使用酶標儀在450 nm模式下檢測光密度值(OD值)。細胞存活率(%)=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×l00%。

1.2.6 RT-PCR法檢測炎癥因子mRNA表達水平 細胞接種于6孔板，PM2.5染毒24 h后，提取總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟說明，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。SYBR Green法檢測IL-1β、TSLP、IL-33的mR-NA表達水平。PCR運行程序為：95℃ 3 min，95℃ 10 s，58℃ 5 s，72℃ 20 s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，分析目的基因的相對表達量。引物見表1。

表1 RT-PCR引物

1.2.7 ELISA法檢測炎性因子分泌水平 細胞接種于12孔板，PM2.5染毒24 h后，收集細胞培養(yǎng)上清液：離心，取上清液。按照試劑盒操作說明，檢測上清液中IL-1β、TSLP、IL-33水平。

1.2.8 Western blot法檢測NF-κB信號通路相關(guān)蛋白 細胞接種于6孔板，PM2.5染毒24 h后，加入RIPA裂解液提取蛋白。根據(jù)Western blot操作方法進行上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，免疫反應(yīng)，顯影。用Image J軟件分析蛋白灰度值，以p-p65與p65灰度值之比來表示蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度PM2.5對HaCaT細胞生成ROS水平的影響 暴露于25 μg/mL PM2.5后，HaCaT細胞內(nèi)ROS生成水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，50～400 μg/mL濃度組細胞內(nèi)ROS水平顯著高于對照組(P<0.01)，且ROS水平呈濃度梯度性增高，400 μg/mL濃度組細胞內(nèi)ROS生成水平最高。表明PM2.5誘導(dǎo)HaCaT細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增多，導(dǎo)致細胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)(圖1)。

2.2 不同濃度PM2.5對HaCaT細胞表達及分泌炎癥因子的影響 如圖2a所示，與對照組比較，HaCaT細胞內(nèi)炎性因子IL-1β、IL-33、TSLP mRNA表達水平，暴露于較高PM2.5濃度(200、400 μg/mL)后，均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；如圖2b所示，與對照組比較，當PM2.5刺激濃度≥50 μg/mL時，HaCaT細胞分泌IL-1β水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；當PM2.5刺激濃度≥25 μg/mL，HaCaT細胞分泌TSLP、IL-33水平顯著增高(P<0.01)。

圖1 不同濃度PM2.5刺激后HaCaT細胞生成ROS水平與對照組(0 μg/mL)比較，*P<0.05，**P<0.01

圖2 不同濃度PM2.5刺激后炎癥因子mRNA表達水平及其分泌濃度與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.3 NAC干預(yù)后，PM2.5對HaCaT細胞增殖活性的影響 對照組HaCaT細胞存活率為(100±3.718)%，200 μg/mL PM2.5組細胞存活率為(74.88±3.487)%，與對照組相比，PM2.5組存活率顯著降低(P<0.01)；不同濃度NAC預(yù)處理細胞1 h，繼而用200 μg/mL PM2.5顆粒染毒24 h，2.5 mM NAC干預(yù)組存活率與PM2.5組比較無明顯差別；5 mM、10 mM NAC干預(yù)組存活率分別為(87.92±3.034)%，(86.98±2.223)%，與PM2.5組比較，存活率均明顯增高(P<0.05)，但仍低于對照組存活率，表明NAC可以部分拮抗PM2.5對HaCaT細胞增殖的抑制作用(圖3)。細胞存活率隨NAC濃度升高而逐漸增高，5 mM NAC提高細胞活力最明顯，后續(xù)實驗將5 mM作為的NAC干預(yù)組工作液濃度。

2.4 NAC干預(yù)后，PM2.5對HaCaT細胞ROS生成水平的影響 與對照組比較，PM2.5組HaCaT細胞產(chǎn)生ROS水平顯著增高(P<0.01)；與PM2.5組比較，NAC干預(yù)組ROS水平顯著降低(P<0.01)，減少約43.35%。但仍高于對照組ROS水平，表明NAC可以部分降低PM2.5誘導(dǎo)的ROS生成(圖4)。

2.5 NAC干預(yù)后，PM2.5對HaCaT細胞分泌炎癥因子水平的影響 與對照組相比，PM2.5組HaCaT細胞分泌IL-1β、TSLP、IL-33水平顯著增高(P<0.01)；與PM2.5組相比，NAC干預(yù)組細胞分泌IL-1β、TSLP、IL-33水平顯著降低(P<0.05)，但仍高于對照組水平，表明NAC可以部分降低PM2.5誘導(dǎo)HaCaT細胞分泌IL-1β、TSLP、IL-33的水平(表2)。

表2 NAC干預(yù)后HaCaT細胞分泌炎癥因子水平

2.6 NAC干預(yù)后，PM2.5對HaCaT細胞表達NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的影響 與對照組比較，PM2.5組細胞內(nèi)NF-κB p-p65蛋白表達水平顯著上調(diào)(P<0.01)，提示PM2.5可以激活細胞內(nèi)NF-κB信號通路；與PM2.5組相比，NAC干預(yù)組NF-κB p-p65蛋白表達水平顯著下調(diào)(P<0.05)，但仍高于對照組水平，表明NAC可以部分降低PM2.5誘導(dǎo)的HaCaT細胞內(nèi)NF-κB p-p65蛋白表達水平(圖5)。

圖3 NAC干預(yù)后HaCaT細胞存活率與對照組比較，**P<0.01，與PM2.5組(200 μg/mL)比較，#P<0.05

3 討論

研究表明PM2.5與特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)、痤瘡、濕疹等炎癥性皮膚病以及皮膚老化密切相關(guān)[8]。Kim等[9]發(fā)現(xiàn)PM2.5濃度與AD癥狀之間呈正相關(guān)，PM2.5每增加1 μg/m3，特應(yīng)性皮炎癥狀增加0.67%。課題組通過meta分析發(fā)現(xiàn)PM2.5濃度每增高10 μg/m3，對過敏性皮膚病影響的合并效應(yīng)量為1.0066(95%CI：1.0033～1.0100)，亞組分析發(fā)現(xiàn)PM2.5對AD影響的合并效應(yīng)量為1.0320(95%CI：1.0056～1.0590)，對濕疹影響的合并效應(yīng)量為1.0066(95%CI：1.0029～1.0103)，表明PM2.5會一定程度增加AD以及濕疹的發(fā)病率[10]。研究還發(fā)現(xiàn)環(huán)境中PM2.5濃度升高與尋常痤瘡門診量的增加顯著相關(guān)[11]。暴露于高濃度的PM2.5還可導(dǎo)致皮膚老化明顯，面部出現(xiàn)更多的色素斑，并增加鼻唇溝褶皺[12]。

PM2.5誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥級聯(lián)反應(yīng)是其皮膚損傷的主要機制，而抗氧化劑和抗炎藥物可能是針對PM2.5引起的皮膚損傷的防治藥物[13]。氧化應(yīng)激是PM2.5誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生的主要損傷效應(yīng)，ROS是一種常用的反映氧化應(yīng)激的指標。ROS是一組含氧的高度活性的化學物質(zhì)，由氧代謝產(chǎn)生，包括羥基自由基、超氧陰離子、過氧化物、單線態(tài)氧等[14]。ROS作為細胞內(nèi)信號分子，與細胞增殖及凋亡密切相關(guān)，同時參與許多炎癥相關(guān)信號通路如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路和NF-κB信號通路的激活[15]。過量的ROS通過損傷脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等生物大分子，引起細胞器應(yīng)激，導(dǎo)致細胞氧化損傷[16]。本研究結(jié)果顯示，ROS生成水平呈PM2.5濃度依賴性增高，提示PM2.5能引起細胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，與Piao等[17]研究結(jié)果，PM2.5引起HaCaT細胞內(nèi)ROS生成增多，導(dǎo)致細胞損傷一致。

炎癥反應(yīng)是PM2.5誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生的另一種損傷效應(yīng)。NF-κB是PM2.5引起炎性損傷過程中較早出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，可以入核調(diào)控TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1β等多種炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄[18]。這些炎癥因子進而可以招募或激活不同類型的免疫細胞，如記憶T細胞和效應(yīng)T細胞及朗格漢斯細胞等，從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[19]。氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)是緊密相關(guān)的過程，在PM2.5誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中，氧化應(yīng)激起主要作用，NF-κB能被多種刺激因素激活，ROS為重要因素之一。一方面PM2.5通過產(chǎn)生ROS誘導(dǎo)NF-κB激活，進而釋放下游炎性因子，啟動炎癥因子的級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致廣泛的炎癥損傷；另一方面，NF-κB反過來誘導(dǎo)ROS和NO產(chǎn)生[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5刺激后細胞內(nèi)NF-κB p-p65蛋白表達水平較對照組顯著增高(P<0.01)，提示細胞內(nèi)NF-κB信號通路激活。隨著PM2.5刺激濃度增高，炎癥因子IL-1β mRNA表達水平及分泌濃度呈逐漸升高趨勢。IL-1β的轉(zhuǎn)錄受NF-κB信號通路調(diào)控，IL-1β可誘導(dǎo)免疫細胞的浸潤及其他炎癥因子的生成，引起炎性損傷。IL-1β與IL-1受體I(IL-1R I)結(jié)合發(fā)揮作用，IL-1R I在許多靶細胞上表達，IL-1β通過上調(diào)淋巴細胞IL-2受體、促進B細胞增殖或促進輔助性T細胞17(Th17)分化等途徑參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[21]。皮膚中IL-1信號傳導(dǎo)對于皮膚的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)是必不可少的，證據(jù)表明，IL-1β參與許多炎癥性皮膚病的發(fā)病機制[22]。

TSLP、IL-33是過敏反應(yīng)相關(guān)的細胞因子，主要通過激活DC細胞，促進Th2型過敏反應(yīng)，與AD等過敏性疾病密切相關(guān)。研究認為AD易感人群角質(zhì)形成細胞受外界環(huán)境因素影響表達TSLP、IL-33等多種關(guān)鍵炎癥因子增多，繼而通過激活皮膚DC細胞，激活并誘導(dǎo)Th2細胞產(chǎn)生IL-4, IL-13,IL-31等細胞因子，反過來作用于角質(zhì)形成細胞，形成炎癥循環(huán)，在AD的發(fā)病機制中至關(guān)重要[23]。本研究結(jié)果顯示，隨著PM2.5刺激濃度增高，炎癥因子TSLP、IL-33 mRNA表達水平及分泌濃度呈逐漸升高趨勢，與姚騏羽等[24]研究結(jié)果一致，姚騏羽等研究發(fā)現(xiàn)PM2.5誘導(dǎo)人原代角質(zhì)形成細胞表達TSLP、IL-33、IL-1α上調(diào)，引起細胞內(nèi)皮膚屏障相關(guān)蛋白表達改變，可能導(dǎo)致皮膚屏障損傷。

為探究氧化應(yīng)激與PM2.5誘導(dǎo)的細胞增殖及炎癥反應(yīng)改變之間的關(guān)系，我們采用抗氧化劑NAC作為干預(yù)條件。NAC是細胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)的前體，可以促進細胞內(nèi)GSH合成，減少ROS的生成，清除已生成的ROS，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用，維持細胞氧化還原狀態(tài)平衡[25]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5引起HaCaT細胞增殖受限，凋亡率增高，NF-κB p-p65蛋白表達逐漸上調(diào)，呈濃度依賴性，當PM2.5濃度為200 μg/mL時對HaCaT細胞造成的損傷較為明顯[7]。因此，本研究中NAC干預(yù)實驗PM2.5濃度定為200 μg/mL，結(jié)果顯示NAC干預(yù)后，細胞內(nèi)ROS生成水平減少，細胞存活率增高，同時NAC還可以顯著抑制PM2.5誘導(dǎo)的NF-κB的活化及IL-1β、TSLP、IL-33分泌水平。NAC干預(yù)實驗結(jié)果間接表明PM2.5誘導(dǎo)的細胞增殖抑制，NF-κB信號激活，IL-1β、TSLP、IL-33表達上調(diào)可能與其引起的細胞氧化應(yīng)激有關(guān)。本實驗結(jié)果與Wang等[26]研究一致，Wang等發(fā)現(xiàn)PM誘導(dǎo)支氣管上皮細胞內(nèi)ROS生成增多，并且激活MAPK信號通路和NF-κB信號通路，導(dǎo)致IL-1β、IL-6、IL-8的表達上調(diào)，而NAC干預(yù)可以顯著減少ROS生成并抑制MAPK和NF-κB通路的激活以及IL-1β、IL-6、IL-8的表達，結(jié)果表明氧化應(yīng)激是PM誘導(dǎo)肺部炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素。而課題組既往研究表明NAC可以抑制PM2.5誘導(dǎo)的肥大細胞內(nèi)ROS生成及肥大細胞活化脫顆粒釋放IL-4和β-Hex[27]。此外，Zhen等[28]發(fā)現(xiàn)抗氧化藥物煙酰胺可以抑制PM2.5誘導(dǎo)的HaCaT細胞內(nèi)ROS生成，進而減輕PM2.5誘導(dǎo)的如脂類、蛋白質(zhì)和DNA分子氧化及細胞凋亡。Jin等[29]研究表明NAC可以減弱PM誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細胞以及小鼠皮膚的炎癥，認為PM導(dǎo)致的皮膚炎癥反應(yīng)與ROS密切相關(guān)。這些研究結(jié)果均提示應(yīng)用抗氧化劑可以保護細胞對抗PM2.5引起的氧化損傷及炎癥損傷。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)PM2.5可以誘導(dǎo)HaCaT細胞內(nèi)ROS生成增多，抑制細胞增殖，引起細胞內(nèi)NF-κB信號通路激活及炎癥因子IL-1β、TSLP 、IL-33表達上調(diào)，這可能是PM2.5導(dǎo)致皮膚炎癥損傷的病理機制之一。抗氧化劑NAC可以在一定程度上拮抗PM2.5引起的細胞增殖抑制和炎癥反應(yīng)，表明氧化應(yīng)激與PM2.5誘導(dǎo)的細胞損傷密切相關(guān)，而NAC可以作為一種有效的保護劑，這為進一步研究PM2.5引起皮膚損傷的機制及其防治提供了參考。