IL-17A對角質形成細胞胰島素抵抗的影響

孫 杰 王 睿 黃 敏 柏 佳 李承新

中國人民解放軍總醫院第一醫學中心皮膚科，北京，100853

近年來有研究發現角質形成細胞(keratinocyte，KC)亦可發生胰島素抵抗[1,2]，從而對銀屑病的發展產生影響，且已證實多種細胞因子如IL-1β、瘦素等均可誘導KC胰島素抵抗[2,3]。白細胞介素17(Interleukin-17，IL-17)作為促炎細胞因子，目前普遍認為其在銀屑病發展中發揮重要的作用[4-6]，且IL-17單克隆抗體對銀屑病治療取得的顯著臨床療效也進一步支持這一觀點[4,7]。但目前尚無IL-17與KC胰島素抵抗之間關聯的研究，故本研究探索IL-17A在KC胰島素抵抗中的作用，為IL-17A在銀屑病發展中的作用提供新依據。

1 資料和方法

1.1 細胞來源 HaCaT細胞購自上海復祥生物科技有限公司,復蘇后應用。臨床資料：選取2019年1～12月在解放軍總醫院第一醫學中心皮膚科病理診斷為尋常型銀屑病的住院患者22例,年齡18～79歲,平均(48.1±3.9)歲,其中男16例,女6例,患者均除外其他自身免疫性疾病。

1.2 主要試劑 EpiLife培養基、Human Keratinocyte Growth Supplement(HKGS)(美國Gibco公司)，重組人IL-17A(美國Peprotech公司)，Anti-IRS-1、Anti-p-IRS-1(Ser636)、Anti-PKB、Anti-p-PKB(Ser437)(美國Cell Signaling公司)，Anti-GLUT4(美國Abcam公司)。

1.3 HaCaT細胞培養 HaCaT細胞用含有1% HKGS的EpiLife培養基培養于37℃，5% CO2培養箱中，1～2天更換培養基1次，當細胞80%融合時進行1∶3傳代。選擇對數生長期HaCaT細胞進行后續實驗。

1.4 Western印跡法檢測胰島素通路相關蛋白 (1)HaCaT細胞以1.5×105cells/mL種于6孔板，用含1% HKGS的EpiLife培養基培養1天后，用不含有HKGS的EpiLife培養基饑餓細胞，使其同步于G0期。對照組不給予藥物刺激，實驗組用含有50 ng/mL的IL-17A工作液刺激HaCaT細胞24 h。刺激結束后用或不用100 nM胰島素刺激細胞10 min或60 min。用RIPA細胞蛋白裂解液提取蛋白。用BCA法測蛋白濃度，濃度均一化處理后，進行SDS-PAGE凝膠電泳。用快速封閉液封閉10 min后，分別加入Anti-IRS-1、Anti-p-IRS-1(Ser636)、Anti-PKB、Anti-p-PKB(Ser437)、Anti-GLUT4(均為1∶1000)，Anti-β-actin(1∶10000)，4℃孵育過夜，漂洗3次后，加入羊抗兔IgG抗體或羊抗鼠IgG抗體(均為1∶10000)，室溫孵育1 h。(2)ECL顯影：滴加顯影液，進行化學發光檢查。

1.5 免疫熒光法檢測葡萄糖轉位蛋白4(glucose transporter 4, GLUT4)的表達 HaCaT細胞以5×104cells/mL種于玻底培養皿，用含1% HKSG的Epilife培養基培養24 h饑餓細胞。對照組不給予藥物刺激，實驗組給予含有50 ng/mL的IL-17A工作液刺激HaCaT細胞24 h后，PBS漂洗3次，4%的多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100室溫作用15 min,3% BSA封閉后，加入Anti-GLUT4(1∶1000)，4℃孵育過夜。PBS漂洗3次后，加入FITC 標記的羊抗兔IgG(1∶10000),室溫孵育1 h。DAPI染核后加入少量PBS，激光共聚焦顯微鏡觀察HaCaT細胞中GLUT4表達情況。

1.6 患者銀屑病嚴重程度的評估和胰島素抵抗指數(HOMA-IR)的計算 兩名有豐富臨床經驗的醫生獨立對銀屑病患者皮損進行銀屑病面積和嚴重程度指數(psoriasis area and severity index，PASI)評分。對患者治療前進行空腹血糖及空腹胰島素濃度檢驗，并計算HOMA-IR=空腹血糖濃度×空腹胰島素濃度/22.5。

1.7 免疫組織化學法檢測患者皮損中p-IRS-1(ser636)的表達并評分 (1)取患者銀屑病皮損處組織，制成石蠟切片，厚度5 μm，梯度乙醇水化后，用乙二胺四乙酸進行抗原修復，自然冷卻至室溫，蒸餾水充分沖洗后，用3%雙氧水去除過氧化物酶。再用PBS充分沖洗后，1% BSA室溫封閉1 h。加入Anti-p-IRS-1(ser636)，4℃過夜孵育。漂洗3次后，加入HRP標記的山羊抗兔IgG。最后用3, 3-四鹽酸二氨基聯苯胺鏡下顯色，蘇木素染色，梯度乙醇脫水、透明、封片。(2)組織化學評分(histochemistry score, H-SCORE)：使用優納公司的PRECICE 500B全自動數字切片掃描系統掃描組織切片,用iViewer軟件放大400倍，每張切片隨機選取3個視野。染色強度分為4級：陰性，0級；弱陽性，1級；陽性，2級；強陽性，3級。根據陽性的百分比進行H-SCORE評分,H-SCORE=∑(Pi×i)=(弱陽性Pi×1)+(陽性Pi×2)+(強陽性Pi×3)(式中Pi表示陽性細胞數量占切片中所有細胞數量的百分數，i代表染色強度；總分范圍為0～300)。

1.8 統計學方法 數據分析采用SPSS 24.0統計軟件,計量資料若符合正態分布，以均數±標準差表示，兩兩比較用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；相關分析用Pearson法(正態分布數據)和Spearman法(非正態分布數據)。檢驗水準α=0.05,以P<0.05為差異有統計學意義。結果采用Graph Pad Prism 8.0軟件繪圖。

2 結果

2.1 IL-17A抑制HaCaT細胞胰島素信號通路激活 實驗結果發現，無論是否給予IL-17A刺激，100 nM胰島素刺激均可增加p-IRS-1(Ser636)，p-PKB(Ser437)的表達(均P<0.05),但胰島素刺激10 min組與60 min組之間，p-IRS-1(Ser636)、p-PKB(Ser437)表達差異無統計意義(均P>0.05)。在胰島素刺激條件下，給予50 ng/mL的IL-17A細胞因子干預后，p-IRS-1/IRS-1顯著升高，p-PKB/PKB的顯著降低(圖1、2)。

2.2 IL-17A抑制HaCaT細胞GLUT4表達 Western印跡法檢測HaCaT細胞中GLUT4蛋白表達水平發現，IL-17A可使GLUT4蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)。見圖3。此外，利用免疫熒光檢測方法觀察HaCaT細胞同樣發現，IL-17A能降低GLUT4在HaCaT細胞中的表達。見圖4。

2.3 銀屑病皮損KC胰島素抵抗與PASI、HOMA-IR呈正相關 對入組的全部患者進行皮損的PASI評分及p-IRS-1(Ser636)的組織化學評分，并進行相關性分析，結果顯示二者呈正相關(r=0.456，P=0.033)。見圖5。其中20例患者完成了空腹血糖和空腹胰島素的檢驗，進行HOMA-IR計算，并分析其與PASI評分的相關性，發現p-IRS-1(Ser636)的組織化學評分與HOMA-IR亦呈正相關(r=0.613，P=0.004)。見圖6。但未發現患者PASI評分與HOMA-IR的存在相關性(P=0.937)。

圖1 蛋白p-IRS-1(Ser636)相對表達量 圖2 蛋白p-PKB(Ser437)相對表達量 #：與無insulin刺激的對照組比較；##：與無insulin刺激的實驗組比較；*：與insulin刺激10 min的對照組比較；**：與insulin刺激60 min的對照組比較，均P<0.05，n=3圖3 蛋白GLUT4相對表達量 *：與對照組相比，P<0.05，n=3

圖4 免疫熒光法檢測HaCaT細胞中GLUT4的表達 圖5 H-score與PASI評分相關性 圖6 H-score與HOMA-IR指數的相關性

3 討論

我們先前研究發現與不伴代謝綜合征的銀屑病患者相比，伴有代謝綜合征的銀屑病患者更容易對治療產生抵抗，且復發間隔縮短[3]。其中胰島素抵抗處于代謝綜合征的中心環節[8，9]，而炎癥可使肌細胞、脂肪細胞、肝細胞、內皮細胞均產生胰島素抵抗，從而表現相應臨床癥狀，如2型糖尿病，血脂異常，心血管疾病等[10，11]。近年來越來越多研究認為KC也可產生胰島素抵抗[1，2，12]。胰島素抵抗可由多種因素引起，目前普遍認為胰島素信號通路受損是各種因素引起胰島素抵抗的共同途徑，特別是在胰島素受體底物(insulin receptor substrate，IRS)的水平上[13]，其中IRS-1/PI3K/PKB通路在胰島素作用途徑中占有極其重要的地位。而炎癥在胰島素抵抗的發生發展中又發揮著重要作用[14-16]，炎癥可以干擾胰島素受體后的信號轉導途徑，如IRS-1/PI3K/PKB通路[17]。正常情況下，胰島素通過與靶細胞上的胰島素受體結合，使其磷酸化而發揮作用，進而可激活下游的IRS-1酪氨酸位點磷酸化，再激活PI3K/PKB，從而發揮正常的生物學效應。但炎癥會誘導IRS-1的絲氨酸/蘇氨酸位點磷酸化，進而抑制IRS-l的酪氨酸磷酸化，從而降低 IRS 的活性，抑制下游信號PKB的磷酸化[17]，因此我們選擇IRS-1的絲氨酸/蘇氨酸位點磷酸化水平的升高和PKB磷酸化水平的減少作為胰島素抵抗的的生物學標記。

本研究顯示加入胰島素刺激后，可激活IRS-1/PI3K/PKB通路，但當給予IL-17A干預后，HaCaT細胞的IRS-1絲氨酸/蘇氨酸位點的磷酸化水平升高，p-PKB表達顯著減少，提示IL-17A干預可能通過抑制的IRS-1/PI3K/PKB途徑，從而介導角質形成細胞胰產生島素抵抗。我們先前研究同樣證明了瘦素可通過相同途徑誘導HaCaT細胞產生胰島素抵抗[3]。亦有研究顯示IL-1β同樣作為一種促炎細胞因子，也可誘導KC產生胰島素抵抗[2]。在小鼠的傷口愈合過程中，TNF-α也可導致KC胰島素信號傳導受損[18]。

GLUT4作為胰島素通路的最終效應蛋白，介導葡萄糖轉運入細胞，促進葡萄糖的利用，其合成、轉位直接受IRS-1/PI3K/PKB途徑的影響，當機體出現PKB磷酸化受到抑制，存在胰島素抵抗時，可直接對GLUT4產生影響[17，19]。本研究發現IL-17A干預HaCaT細胞后，Western印跡法和免疫熒光法都提示GLUT4蛋白表達量降低，進一步提示IL-17A可能抑制HaCaT細胞IRS-1/PI3K/PKB/GLUT4通路，誘導胰島素抵抗。

在體外實驗驗證了IL-17A可以誘導HaCaT細胞產生胰島素抵抗的基礎上，我們選擇在胰島素抵抗中處于中心位置的IRS作為指標，用患者皮損處p-IRS-1(Ser636)的組織化學評分來反應KC胰島素抵抗水平，相關性分析結果提示KC胰島素抵抗水平同患者PASI評分及HOMA-IR呈正相關，提示KC胰島素抵抗可影響銀屑病皮損的嚴重程度。雖然有研究表明銀屑病患者胰島素抵抗指數與銀屑病嚴重程度呈正相關[20]，本研究未發現HOMA-IR與PASI評分有相關性，這可能與我們收取的血清樣品的數量較少有關。此外，Buerger等[2]先前研究已發現KC胰島素抵抗可阻礙KC分化，我們課題組的研究亦證明這一結論[3]。目前多項研究發現銀屑病患者更易合并代謝綜合征[21-23]，其中Singh等[21]研究發現代謝綜合征與銀屑病的嚴重程度有顯著關聯，且合并代謝綜合征的銀屑病患者，IL-17水平顯著升高[24]，又因胰島素抵抗處于代謝綜合征的中心環節[8，9]，因此我們推測患者皮損嚴重程度與KC胰島素抵抗水平存在相關性是因為KC在炎癥因子IL-17的刺激下，可以產生KC胰島素抵抗，阻礙KC分化，從而對銀屑病的皮損嚴重程度產生影響。

綜上所述，我們研究發現IL-17A可促進IRS-1絲氨酸化位點磷酸化水平表達升高，從而可能通過抑制HaCaT細胞IRS-1/PI3K/PKB/GLUT4信號通路，介導HaCaT細胞產生胰島素抵抗。同時發現銀屑病皮損處p-IRS-1(Ser636)表達水平同銀屑病病情和胰島素抵抗程度均呈顯著正相關，因此我們推測IL-17A可能通過誘導KC產生胰島素抵抗，從而對銀屑病的病情嚴重程度產生一定影響。