補腎化瘀泄?jié)岱酵ㄟ^調(diào)控細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號通路阻抑人腎小管上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的機制研究

袁雅琪 朱曉琳 殷立平 尹文雁 凌淑洵 高雪琴 李 立

（南京中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇南京210017）

慢性腎臟病（CKD）是全世界范圍內(nèi)嚴重威脅人類健康的公共衛(wèi)生難題。引起CKD的多種因素會誘導致纖維化因子和致炎因子產(chǎn)生增加，進而通過多種途徑引起腎臟組織結(jié)構(gòu)變化，表現(xiàn)為細胞極性消失、骨架重塑、遷移和侵襲性增強，上皮組織消失，成纖維細胞、炎癥細胞聚集，細胞外基質(zhì)沉積，發(fā)生纖維化，最終造成腎功能進行性喪失[1]。大量研究表明，在腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展中，腎小管上皮細胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）扮演著極其重要的角色，即使在CKD早期也可檢測到上皮、間質(zhì)標志物的相互轉(zhuǎn)變[2-3]。

轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）被公認為最重要的EMT正向調(diào)節(jié)因子，在誘導腎小管上皮細胞EMT中扮演了極其重要的角色[4]。Smad信號能夠介導一系列的分子事件，而這些事件是EMT進程所必需的。TGF-β/Smad通路是誘導EMT的經(jīng)典信號通路[5]，而Wnt、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）等多種信號通路常常與其發(fā)生交叉對話。補腎化瘀泄?jié)岱绞悄暇┲嗅t(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院腎臟科在長期臨床用藥過程中的經(jīng)驗方，對緩解CKD的進展具有較好的臨床療效。本研究擬探討補腎化瘀泄?jié)岱皆谌四I小管上皮細胞（HK-2）EMT中的作用及其干預機制，為其臨床使用提供理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞HK-2細胞株購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.2 藥物與試劑補腎化瘀泄?jié)岱剿幬锝M成：生黃芪30 g，黨參15 g，蒼術15 g，生地黃15 g，土茯苓30 g，丹參15 g，桃仁10 g，水蛭3 g，虎杖15 g，白花蛇舌草15 g，生大黃10 g。中藥按處方量173 g加水500 mL，煎煮2次，濾過除去雜質(zhì)，進一步水煎濃縮，濾過除菌備用。TGF-β1購自美國R&D公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；E-鈣黏蛋白（E-cadherin，批號：3195）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA，批號：19245）、波形蛋白（Vimentin，批號：5741）、β-肌動蛋白（β-actin，批號：4970）、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK，批號：4695）、磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（p-ERK，批號：4370）、Smad2/3（批號：8685）、p-Smad2/3（批號：18338）多克隆抗體，免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號：7074），購自美國CST公司；絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）抑制劑（PD98059，批號：MP23）購自上海愛必信生物科技有限公司；RIPA細胞裂解液（P0013B）購自上海碧云天公司；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司；RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；超敏ECL發(fā)光液購自美國Millipore公司。

1.3 主要儀器倒置相差顯微鏡；多功能酶標儀（PerkinElmer）；熒光定量PCR循環(huán)儀；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽（BIO-RAD）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)將HK-2以貼壁方式培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液（含青霉素100 U/mL+鏈霉素100 μg/mL），放置于37 ℃含95%空氣、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于細胞對數(shù)生長期進行實驗。

2.2 細胞活力檢測待HK-2生長至80%～90%時，將其消化重懸接種于96孔板內(nèi)培養(yǎng)，待細胞貼壁后進行分組與干預。設空白組和補腎化瘀泄?jié)岱讲煌瑒┝浚?、2、5、10 ng/mL）組，每組設5個復孔。培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑，孵育4 h后，測定波長450 nm處各孔OD值，取平均值進行分析。

2.3 細胞形態(tài)學觀察細胞分組同步化培養(yǎng)，待生長至70%左右融合后，空白組仍于正常培養(yǎng)液中培養(yǎng)，模型組于正常培養(yǎng)液加TGF-β1 5 ng/mL[6]，中藥低、中、高劑量組在模型組的基礎上加入低、中、高劑量（1、2、5 ng/mL）補腎化瘀泄?jié)岱剿鍎└深A，孵育48 h后，倒置顯微鏡下（×40）觀察細胞形態(tài)。

2.4 Western blot檢測相關蛋白表達細胞同步化培養(yǎng)后分為空白組、模型組（TGF-β1 5 ng/mL）、PD98059干 預 組（TGF-β1 5 ng/mL+PD98059 10 μmol/L）和中藥低、中、高劑量組（TGF-β1 5 ng/mL+補腎化瘀泄?jié)岱剿鍎?、2、5 ng/mL），干預24 h，收集細胞。采用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、EDTA）抽提總蛋白，BCA法進行蛋白定量，蛋白樣品20 μg每泳道加入到8%SDS-PAGE凝膠中進行電泳分離，將蛋白電轉(zhuǎn)至PDVF膜上，5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h，一抗4 ℃過夜，TBST漂洗3次后加入辣根堿過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗3次后，于PVDF膜上滴加ECL顯影液，凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析條帶。

2.5 Real-time PCR檢測相關基因mRNA的表達細胞同步化培養(yǎng)后分為空白組、模型組（TGF-β1 5 ng/mL）和中藥低、中、高劑量組（TGF-β1 5 ng/mL+補腎化瘀泄?jié)岱剿鍎?、2、5 ng/mL），干預24 h后采用TRIzol裂解細胞，室溫靜置5 min，加入氯仿充分振蕩15 s，室溫靜置3 min，12 000×g、4 ℃離心15 min后提取上清，加入異丙醇，輕輕混勻后室溫靜置10 min，12 000×g、4 ℃離心10 min，棄上清，加入75%乙醇輕輕洗滌，7500×g、4 ℃離心5 min，棄上清，室溫干燥沉淀后采用適量DEPC水溶解總RNA。測定總RNA濃度及純度后，采用500 ng RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)說明書，加入Master Mix和RNase-free dH2O，在37℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃條件下合成cDNA。根據(jù)Real-time PCR說明書，在PCR反應板中加入SYBR Premi×E×TaqⅡ、cDNA及目的基因引物，在50 ℃ 20 s、95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 40 s條件下采用熒光定量PCR循環(huán)儀擴增40個循環(huán)，相對定量法（2-△△Ct）進行統(tǒng)計分析。根據(jù)Gen Bank E-cadherin、α-SMA、Vimentin及β-actin基因全長序列，利用引物設計軟件Primer 5.0設計E-cadherin、α-SMA、Vimentin及β-actin的引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以（±s）表示，2組間比較采用獨立樣本 t 檢驗，3組及以上各組間的比較采用ANOVA單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 補腎化瘀泄?jié)岱綄K-2細胞活力的影響與空白組比較，1、2、5 ng/mL補腎化瘀泄?jié)岱剿鍎└深A對HK-2細胞活力無影響，但當劑量達到10 ng/mL時，細胞活力有所下降（P＜0.05），考慮可能為細胞毒性作用，故后續(xù)實驗選用濃度1、2、5 ng/mL的補腎化瘀泄?jié)岱剿鍎Ｒ妶D1。

圖1 不同劑量補腎化瘀泄?jié)岱阶饔?4 h后HK-2細胞活力比較（±s，n=3）

3.2 補腎化瘀泄?jié)岱綄GF-β1誘導HK-2 EMT細胞形態(tài)學的影響空白組HK-2細胞呈“鵝卵石樣”外觀；模型組少見鵝卵石樣細胞，多見EMT特有的“紡錘形”結(jié)構(gòu)，細胞變瘦長，呈梭形，似成纖維細胞樣；經(jīng)低、中、高劑量補腎化瘀泄?jié)岱剿鍎└深A后上述改變得到一定程度的抑制，部分細胞逆轉(zhuǎn)為鵝卵石樣，并以高劑量組作用最為明顯。見圖2。

3.3 補腎化瘀泄?jié)岱綄GF-β1誘導HK-2 EMT標記物的影響中藥各劑量組α-SMA、Vimentin蛋白、mRNA表達較模型組明顯下降（P＜0.05），E-cadherin蛋白、mRNA表達較模型組明顯上升（P＜0.05），見圖3、圖4。以上變化以高劑量組最為明顯。

3.4 補腎化瘀泄?jié)岱綄GF-β1誘導HK-2 ERK及Smad2/3 的影響與空白組比較，模型組HK-2細胞經(jīng)TGF-β1刺激后，磷酸化ERK、磷酸化Smad2/3蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，低、中、高劑量補腎化瘀泄?jié)岱骄苡行б种艵RK及Smad2/3蛋白高磷酸化水平（P＜0.05），以高劑量影響最為明顯。此外，TGF-β1和補腎化瘀泄?jié)岱綄RK及Smad2/3總蛋白的表達無明顯影響。見圖5。

3.5 補腎化瘀泄?jié)岱綄Ρ菶RK通路抑制劑對TGF-β1誘導HK-2 EMT及Smad2/3的影響結(jié)果顯示：與模型組比較，PD98059干預組、中藥高劑量組α-SMA、Vimentin、磷酸化Smad2/3蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05）；Smad2/3總蛋白的表達無明顯差異。見圖6。

4 討論

腎臟纖維化是各種CKD發(fā)展到最后的共同病理過程，是導致腎功能損傷的關鍵因素。近年來，人們在腎臟纖維化的分子和細胞調(diào)控因子方面做了大量研究。研究證明EMT是腎臟纖維化的一個重要進程，抑制EMT成為預防腎臟纖維化發(fā)生和發(fā)展的有效手段[7]。通常，在腎臟纖維化EMT過程中，腎小管上皮細胞失去上皮細胞標記物，如黏附蛋白E-cadherin表達下調(diào)；獲得間充質(zhì)細胞標記物，表 現(xiàn) 為Vimentin、α-SMA、Snail表達上調(diào)[8]。TGF-β1作為最重要的促纖維化因子，在腎臟纖維化中也發(fā)揮了關鍵作用[9]。研究表明，TGF-β1可以通過Smad依賴性和Smad非依賴性通路發(fā)揮生物學功能[10]，TGF-β1下游信號包括了細胞質(zhì)中Smad2/3 蛋白磷酸化，磷酸化Smad2/3與Smad4 形成復合物，隨之轉(zhuǎn)移到細胞核中，激活纖維化相關轉(zhuǎn)錄因子[11]。此外，TGF-β1/Smad信號通路與ERK信號通路之間的交互關系在腎臟纖維化中也已經(jīng)被證實[12]。

圖2 各組HK-2 EMT細胞形態(tài)學比較（×40）

圖4 各組TGF-β1誘導HK-2 EMT標記物mRNA表達比較（±s，n=3）

圖5 各組TGF-β1誘導HK-2 ERK及Smad2/3 蛋白表達比較（±s，n=3）

圖6 各組TGF-β1誘導HK-2 EMT及Smad2/3 蛋白表達比較（±s，n=3）

本研究采用TGF-β1刺激HK-2誘導EMT，觀察發(fā)現(xiàn)HK-2細胞形態(tài)出現(xiàn)了明顯改變，且EMT標記物E-cadherin蛋白及mRNA表達水平明顯下降，Vimentin、α-SMA蛋白及mRNA表達水平明顯上調(diào)，以上結(jié)果均提示HK-2細胞EMT體外模型構(gòu)建成功。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)TGF-β1刺激后，ERK及Smad2/3蛋白磷酸化水平顯著升高；但使用ERK通路抑制劑預處理，再給予TGF-β1干預后，HK-2 EMT標記物Vimentin、α-SMA蛋白表達下降，同時Smad2/3磷酸化水平也有所下降。這些現(xiàn)象反映出：ERK信號通路參與了TGF-β1誘導的HK-2細胞EMT，并且Smad2/3蛋白可能是ERK信號通路的下游信號分子。

CKD可歸屬于中醫(yī)學“水腫”“關格”“虛勞”“水毒癥”等范疇，乃本虛標實證，本虛可為氣、血、陰、陽虧虛，標實以水濕、濕毒、血瘀多見，病位在腎，可累及多臟。補腎化瘀泄?jié)岱交米阅I氣丸合桃紅四物湯，可補虛祛邪。方中黃芪益氣固表、利水載毒而出，黨參健脾益腎、益氣行水，蒼術利水解表、托毒外出，生地黃清熱涼血，土茯苓、虎杖、白花蛇舌草清利濕熱，丹參、桃仁活血化瘀，水蛭補肝腎、活血化瘀，大黃瀉下通便排毒兼活血化瘀。諸藥合用，共奏補腎益氣、活血化瘀、泄?jié)崤哦局πА１狙芯繉⒋酥兴帍头街瞥刹煌瑒┝克鍎└深AHK-2，結(jié)果表明：補腎化瘀泄?jié)岱侥茉谝欢ǔ潭壬铣蕜┝恳蕾囆缘啬孓D(zhuǎn)TGF-β1誘導的EMT標記物E-cadherin、Vimentin、α-SMA蛋白及mRNA的表達；同時，與模型組比較，補腎化瘀泄?jié)岱礁鲃┝拷MERK磷酸化及Smad2/3磷酸化水平均有一定程度的下調(diào)，且以5 ng/mL效果最佳。這表明補腎化瘀泄?jié)岱皆谧枰諬K-2 EMT的同時還抑制了ERK及Smad2/3蛋白活性。在與ERK通路抑制劑PD98059干預組比較后，我們發(fā)現(xiàn)補腎化瘀泄?jié)岱秸{(diào)控EMT標記物及Smad2/3的作用與ERK通路抑制劑的效果類似，表明補腎化瘀泄?jié)岱骄徑釫MT的作用很有可能與ERK通路有關。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，補腎化瘀泄?jié)岱胶芸赡芡ㄟ^調(diào)控ERK信號通路，抑制Smad2/3蛋白磷酸化，從而實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)HK-2 EMT的作用。但本研究只觀察了TGF-β1/Smad信號通路與ERK信號通路之間的交互關系，而中藥復方發(fā)揮療效是多成分多靶點共同作用的結(jié)果，是否存在調(diào)節(jié)其他信號通路的功能，將是我們下一步研究的方向。