補腎化瘀泄濁方通過調控細胞外調節蛋白激酶信號通路阻抑人腎小管上皮細胞間充質轉化的機制研究

袁雅琪 朱曉琳 殷立平 尹文雁 凌淑洵 高雪琴 李 立

（南京中醫藥大學第二附屬醫院腎內科，江蘇南京210017）

慢性腎臟病（CKD）是全世界范圍內嚴重威脅人類健康的公共衛生難題。引起CKD的多種因素會誘導致纖維化因子和致炎因子產生增加，進而通過多種途徑引起腎臟組織結構變化，表現為細胞極性消失、骨架重塑、遷移和侵襲性增強，上皮組織消失，成纖維細胞、炎癥細胞聚集，細胞外基質沉積，發生纖維化，最終造成腎功能進行性喪失[1]。大量研究表明，在腎臟纖維化的發生發展中，腎小管上皮細胞的上皮間充質轉化（EMT）扮演著極其重要的角色，即使在CKD早期也可檢測到上皮、間質標志物的相互轉變[2-3]。

轉化生長因子β（TGF-β）被公認為最重要的EMT正向調節因子，在誘導腎小管上皮細胞EMT中扮演了極其重要的角色[4]。Smad信號能夠介導一系列的分子事件，而這些事件是EMT進程所必需的。TGF-β/Smad通路是誘導EMT的經典信號通路[5]，而Wnt、細胞外調節蛋白激酶（ERK）等多種信號通路常常與其發生交叉對話。補腎化瘀泄濁方是南京中醫藥大學第二附屬醫院腎臟科在長期臨床用藥過程中的經驗方，對緩解CKD的進展具有較好的臨床療效。本研究擬探討補腎化瘀泄濁方在人腎小管上皮細胞（HK-2）EMT中的作用及其干預機制，為其臨床使用提供理論依據。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞HK-2細胞株購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

1.2 藥物與試劑補腎化瘀泄濁方藥物組成：生黃芪30 g，黨參15 g，蒼術15 g，生地黃15 g，土茯苓30 g，丹參15 g，桃仁10 g，水蛭3 g，虎杖15 g，白花蛇舌草15 g，生大黃10 g。中藥按處方量173 g加水500 mL，煎煮2次，濾過除去雜質，進一步水煎濃縮，濾過除菌備用。TGF-β1購自美國R&D公司；胎牛血清、DMEM培養基購自美國Gibco公司；E-鈣黏蛋白（E-cadherin，批號：3195）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA，批號：19245）、波形蛋白（Vimentin，批號：5741）、β-肌動蛋白（β-actin，批號：4970）、細胞外調節蛋白激酶（ERK，批號：4695）、磷酸化細胞外調節蛋白激酶（p-ERK，批號：4370）、Smad2/3（批號：8685）、p-Smad2/3（批號：18338）多克隆抗體，免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號：7074），購自美國CST公司；絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）抑制劑（PD98059，批號：MP23）購自上海愛必信生物科技有限公司；RIPA細胞裂解液（P0013B）購自上海碧云天公司；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司；RT-PCR逆轉錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；超敏ECL發光液購自美國Millipore公司。

1.3 主要儀器倒置相差顯微鏡；多功能酶標儀（PerkinElmer）；熒光定量PCR循環儀；垂直電泳儀、轉膜槽（BIO-RAD）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養將HK-2以貼壁方式培養，培養基為含10%胎牛血清的DMEM培養液（含青霉素100 U/mL+鏈霉素100 μg/mL），放置于37 ℃含95%空氣、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養，于細胞對數生長期進行實驗。

2.2 細胞活力檢測待HK-2生長至80%～90%時，將其消化重懸接種于96孔板內培養，待細胞貼壁后進行分組與干預。設空白組和補腎化瘀泄濁方不同劑量（1、2、5、10 ng/mL）組，每組設5個復孔。培養24 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑，孵育4 h后，測定波長450 nm處各孔OD值，取平均值進行分析。

2.3 細胞形態學觀察細胞分組同步化培養，待生長至70%左右融合后，空白組仍于正常培養液中培養，模型組于正常培養液加TGF-β1 5 ng/mL[6]，中藥低、中、高劑量組在模型組的基礎上加入低、中、高劑量（1、2、5 ng/mL）補腎化瘀泄濁方水煎劑干預，孵育48 h后，倒置顯微鏡下（×40）觀察細胞形態。

2.4 Western blot檢測相關蛋白表達細胞同步化培養后分為空白組、模型組（TGF-β1 5 ng/mL）、PD98059干 預 組（TGF-β1 5 ng/mL+PD98059 10 μmol/L）和中藥低、中、高劑量組（TGF-β1 5 ng/mL+補腎化瘀泄濁方水煎劑1、2、5 ng/mL），干預24 h，收集細胞。采用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、EDTA）抽提總蛋白，BCA法進行蛋白定量，蛋白樣品20 μg每泳道加入到8%SDS-PAGE凝膠中進行電泳分離，將蛋白電轉至PDVF膜上，5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h，一抗4 ℃過夜，TBST漂洗3次后加入辣根堿過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗3次后，于PVDF膜上滴加ECL顯影液，凝膠成像系統掃描并分析條帶。

2.5 Real-time PCR檢測相關基因mRNA的表達細胞同步化培養后分為空白組、模型組（TGF-β1 5 ng/mL）和中藥低、中、高劑量組（TGF-β1 5 ng/mL+補腎化瘀泄濁方水煎劑1、2、5 ng/mL），干預24 h后采用TRIzol裂解細胞，室溫靜置5 min，加入氯仿充分振蕩15 s，室溫靜置3 min，12 000×g、4 ℃離心15 min后提取上清，加入異丙醇，輕輕混勻后室溫靜置10 min，12 000×g、4 ℃離心10 min，棄上清，加入75%乙醇輕輕洗滌，7500×g、4 ℃離心5 min，棄上清，室溫干燥沉淀后采用適量DEPC水溶解總RNA。測定總RNA濃度及純度后，采用500 ng RNA進行逆轉錄，根據說明書，加入Master Mix和RNase-free dH2O，在37℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃條件下合成cDNA。根據Real-time PCR說明書，在PCR反應板中加入SYBR Premi×E×TaqⅡ、cDNA及目的基因引物，在50 ℃ 20 s、95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 40 s條件下采用熒光定量PCR循環儀擴增40個循環，相對定量法（2-△△Ct）進行統計分析。根據Gen Bank E-cadherin、α-SMA、Vimentin及β-actin基因全長序列，利用引物設計軟件Primer 5.0設計E-cadherin、α-SMA、Vimentin及β-actin的引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.6 統計學方法采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析。數據以（±s）表示，2組間比較采用獨立樣本 t 檢驗，3組及以上各組間的比較采用ANOVA單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 補腎化瘀泄濁方對HK-2細胞活力的影響與空白組比較，1、2、5 ng/mL補腎化瘀泄濁方水煎劑干預對HK-2細胞活力無影響，但當劑量達到10 ng/mL時，細胞活力有所下降（P＜0.05），考慮可能為細胞毒性作用，故后續實驗選用濃度1、2、5 ng/mL的補腎化瘀泄濁方水煎劑。見圖1。

圖1 不同劑量補腎化瘀泄濁方作用24 h后HK-2細胞活力比較（±s，n=3）

3.2 補腎化瘀泄濁方對TGF-β1誘導HK-2 EMT細胞形態學的影響空白組HK-2細胞呈“鵝卵石樣”外觀；模型組少見鵝卵石樣細胞，多見EMT特有的“紡錘形”結構，細胞變瘦長，呈梭形，似成纖維細胞樣；經低、中、高劑量補腎化瘀泄濁方水煎劑干預后上述改變得到一定程度的抑制，部分細胞逆轉為鵝卵石樣，并以高劑量組作用最為明顯。見圖2。

3.3 補腎化瘀泄濁方對TGF-β1誘導HK-2 EMT標記物的影響中藥各劑量組α-SMA、Vimentin蛋白、mRNA表達較模型組明顯下降（P＜0.05），E-cadherin蛋白、mRNA表達較模型組明顯上升（P＜0.05），見圖3、圖4。以上變化以高劑量組最為明顯。

3.4 補腎化瘀泄濁方對TGF-β1誘導HK-2 ERK及Smad2/3 的影響與空白組比較，模型組HK-2細胞經TGF-β1刺激后，磷酸化ERK、磷酸化Smad2/3蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，低、中、高劑量補腎化瘀泄濁方均能有效抑制ERK及Smad2/3蛋白高磷酸化水平（P＜0.05），以高劑量影響最為明顯。此外，TGF-β1和補腎化瘀泄濁方對ERK及Smad2/3總蛋白的表達無明顯影響。見圖5。

3.5 補腎化瘀泄濁方對比ERK通路抑制劑對TGF-β1誘導HK-2 EMT及Smad2/3的影響結果顯示：與模型組比較，PD98059干預組、中藥高劑量組α-SMA、Vimentin、磷酸化Smad2/3蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05）；Smad2/3總蛋白的表達無明顯差異。見圖6。

4 討論

腎臟纖維化是各種CKD發展到最后的共同病理過程，是導致腎功能損傷的關鍵因素。近年來，人們在腎臟纖維化的分子和細胞調控因子方面做了大量研究。研究證明EMT是腎臟纖維化的一個重要進程，抑制EMT成為預防腎臟纖維化發生和發展的有效手段[7]。通常，在腎臟纖維化EMT過程中，腎小管上皮細胞失去上皮細胞標記物，如黏附蛋白E-cadherin表達下調；獲得間充質細胞標記物，表 現 為Vimentin、α-SMA、Snail表達上調[8]。TGF-β1作為最重要的促纖維化因子，在腎臟纖維化中也發揮了關鍵作用[9]。研究表明，TGF-β1可以通過Smad依賴性和Smad非依賴性通路發揮生物學功能[10]，TGF-β1下游信號包括了細胞質中Smad2/3 蛋白磷酸化，磷酸化Smad2/3與Smad4 形成復合物，隨之轉移到細胞核中，激活纖維化相關轉錄因子[11]。此外，TGF-β1/Smad信號通路與ERK信號通路之間的交互關系在腎臟纖維化中也已經被證實[12]。

圖2 各組HK-2 EMT細胞形態學比較（×40）

圖4 各組TGF-β1誘導HK-2 EMT標記物mRNA表達比較（±s，n=3）

圖5 各組TGF-β1誘導HK-2 ERK及Smad2/3 蛋白表達比較（±s，n=3）

圖6 各組TGF-β1誘導HK-2 EMT及Smad2/3 蛋白表達比較（±s，n=3）

本研究采用TGF-β1刺激HK-2誘導EMT，觀察發現HK-2細胞形態出現了明顯改變，且EMT標記物E-cadherin蛋白及mRNA表達水平明顯下降，Vimentin、α-SMA蛋白及mRNA表達水平明顯上調，以上結果均提示HK-2細胞EMT體外模型構建成功。此外，本研究還發現經TGF-β1刺激后，ERK及Smad2/3蛋白磷酸化水平顯著升高；但使用ERK通路抑制劑預處理，再給予TGF-β1干預后，HK-2 EMT標記物Vimentin、α-SMA蛋白表達下降，同時Smad2/3磷酸化水平也有所下降。這些現象反映出：ERK信號通路參與了TGF-β1誘導的HK-2細胞EMT，并且Smad2/3蛋白可能是ERK信號通路的下游信號分子。

CKD可歸屬于中醫學“水腫”“關格”“虛勞”“水毒癥”等范疇，乃本虛標實證，本虛可為氣、血、陰、陽虧虛，標實以水濕、濕毒、血瘀多見，病位在腎，可累及多臟。補腎化瘀泄濁方化裁自腎氣丸合桃紅四物湯，可補虛祛邪。方中黃芪益氣固表、利水載毒而出，黨參健脾益腎、益氣行水，蒼術利水解表、托毒外出，生地黃清熱涼血，土茯苓、虎杖、白花蛇舌草清利濕熱，丹參、桃仁活血化瘀，水蛭補肝腎、活血化瘀，大黃瀉下通便排毒兼活血化瘀。諸藥合用，共奏補腎益氣、活血化瘀、泄濁排毒之功效。本研究將此中藥復方制成不同劑量水煎劑干預HK-2，結果表明：補腎化瘀泄濁方能在一定程度上呈劑量依賴性地逆轉TGF-β1誘導的EMT標記物E-cadherin、Vimentin、α-SMA蛋白及mRNA的表達；同時，與模型組比較，補腎化瘀泄濁方各劑量組ERK磷酸化及Smad2/3磷酸化水平均有一定程度的下調，且以5 ng/mL效果最佳。這表明補腎化瘀泄濁方在阻抑HK-2 EMT的同時還抑制了ERK及Smad2/3蛋白活性。在與ERK通路抑制劑PD98059干預組比較后，我們發現補腎化瘀泄濁方調控EMT標記物及Smad2/3的作用與ERK通路抑制劑的效果類似，表明補腎化瘀泄濁方緩解EMT的作用很有可能與ERK通路有關。

綜上所述，本研究發現，補腎化瘀泄濁方很可能通過調控ERK信號通路，抑制Smad2/3蛋白磷酸化，從而實現逆轉HK-2 EMT的作用。但本研究只觀察了TGF-β1/Smad信號通路與ERK信號通路之間的交互關系，而中藥復方發揮療效是多成分多靶點共同作用的結果，是否存在調節其他信號通路的功能，將是我們下一步研究的方向。