基于Wnt/β-catenin 信號通路探討青藤堿聯合脈沖射頻緩解SNL 大鼠疼痛的作用機制

王文輝，郭 剛，李長文，陳 良

1 蘭州大學第一醫院，甘肅 蘭州 730000；2 定西市第二人民醫院；3 定西市人民醫院

神經病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是一種由于軀體感覺神經損傷或障礙引起的全球性的疼痛疾病，目前仍無可靠的治療方法，不僅嚴重影響患者的生存質量［1］，給個人、家庭和社會也帶來了巨大的經濟負擔［2］，而且可誘發患者焦慮、抑郁等負面情緒。據不完全統計，我國目前NP 患者至少有1600萬［3］，而且隨著年齡的增長而增加；同時NP 的具體發病機制不清，使得目前缺乏有效的治療手段，因此，尋找有效的治療方法具有重要的意義。

疼痛是機體的自我保護性機制，主要表現為離子通道的改變、局部神經炎癥、異位刺激和錯誤信號轉導等［4］。隨著對神經病理性疼痛研究的不斷深入，藥物治療的新靶點不斷被發現，如小膠質細胞通路［5］、Notch 信號通路［6］、P38MAPK 通路［7］、Wnt 信號通路等［8］。研究還發現，在 NP 的神經性炎癥發展中Wnt/β-catenin 信號通路可能起到重要的作用［9］，Wnt/β-catenin信號通路會導致與NP有關的炎性因子的過表達等［10］。

青藤堿是從中藥青風藤中提取出的具有抗炎、鎮痛、免疫抑制等藥理作用的生物堿單體［11-13］，臨床廣泛應用于急性關節炎及類風濕性關節炎等疼痛性自身免疫疾病的治療［14-15］。但是單純的藥物治療無法完全逆轉患者疼痛的病理過程，脈沖射頻聯合藥物治療是近年應用較為廣泛的一種治療神經性疼痛性疾病的方法，且療效較佳［16-17］。但是青藤堿聯合脈沖射頻治療法對神經病理性疼痛的治療效果尚無報道，本研究利用青藤堿及脈沖射頻治療法治療脊神經結扎（spinal nerve ligation，SNL）持續性術后疼痛大鼠，探討該療法通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路對大鼠SNL后神經痛的治療效果。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器青藤堿（115-53-7，上海源葉生物科技有限公司）；RIPA 裂解液（Beyotime，中國江蘇，批號：P0013B）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（Beyotime，批號：P0010）、增強型化學發光試劑（Beyotime，批號 ：P0018）、PVDF 膜（Merck Millipore，批號：HVHP29325）、SDS-PAGE 凝膠試劑盒（Beyotime，批號：P0012A）；兔抗C-fos 多克隆抗體（Abcam，批號：ab209794）；兔抗 Wnt-3α 多克隆抗體（Abcam，批號：ab32249）；兔抗β-catenin 多克隆抗體（Abcam，批號：ab16051）；Trizol（Takara，批號：9109）；PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara，批號：RR047A）；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Takara，批號：RR820L）。

1.2 實驗動物采用8 周齡SD 雄性大鼠135 只，體質量約180～200 g，購自蘭州大學實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK（甘）2018-0002。飼養條件：在室溫下給予正常完全營養和自來水常規飼養，自由飲食進水，光照周期12 h/12 h。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組方法 采用隨機數字表法將135 只大鼠分為5 組：假手術組、模型組、青藤堿組、射頻治療組及聯合治療組。見表1。

表1 實驗大鼠分組方法 只

1.3.2 模型制備 將SD 大鼠麻醉后進行脊神經結扎（spinal nerve ligation，SNL）模型制備，沿L4～S1棘突做后正中偏右切口，暴露橫突的根部，用彎成直角的針頭向頭端插入孔內。當針頭觸及DRG 或神經根可引起同側后肢肌肉輕微抽動，退出針頭。結扎神經，縫合，腹腔連續3 天注射青霉素。假手術組除不進行背根神經結扎外，其余操作同其他組。

1.3.3 給藥方法 術后第1 天開始（SNL 當天視第 0 天）進行藥物［青藤堿 8 mg/（kg·d）］或/和脈沖射頻治療（在背根神經結扎近端，距線結5 mm處，脈寬20 ms、頻率500 kHz，脈沖頻率2 Hz，溫度42℃，持續時間8 min）。假手術組與模型組給予等量生理鹽水灌胃。

1.3.4 機械痛閾測量 所有大鼠在手術前1 天及術后第1、3、5、7、14 天給藥或/和脈沖射頻干預治療2 h后，檢測各組大鼠進行機械縮足反應閾值（mechanical withdraw threshold，MWT）。每只大鼠每次檢測3 次，記下數值后求其均值，每次間斷開5 min。

1.3.5 樣品采集 各組大鼠SNL 術后3、7、14 天行為能力測試結束后，各組取6 只大鼠麻醉后處死，快速而準確地切取各組大鼠脊髓背根神經節（dorsal root ganglion，DRG）的 L4～L6節段，立即置于液氮中凍存用于Western Blot 及PCR 檢測。另取3 只大鼠麻醉后，開胸經左心室插管進入主動脈根部，剪開右心耳，灌注PBS 沖盡血液，然后采用4℃4%多聚甲醛300 mL 灌注固定1 h。取L4～5節段背根神經節，用于免疫組化檢測。

1.3.6 Q-PCR 實驗 取收集到的DRG，采用Trizol 法提取 DRG 中總 RNA。并將 RNA 濃度統一稀釋至500 ng/mL，用逆轉錄試劑盒進行反轉錄，獲得的cDNA 作為模板，擴增白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因。擴增引物序列表見表2。反應條件：預變性，95℃10 min，1個循環；熱循環，95℃15 s，60℃15 s，72℃30 s，40個循環，擴增結束后確認擴增曲線和溶解曲線，確認得出數據的可信性。計算基因的相對表達量F=2-△△Ct，△△Ct=（待測樣品的目的基因的Ct 的平均值-待測樣本的內參基因的Ct 的平均值）-（對照樣品的目的基因的Ct的平均值-對照樣本的內參基因的Ct的平均值）。

表2 引物序列

1.3.7 Western bloting實驗 取收集到的DRG，向DRG中加入200 μL蛋白裂解液（含1 mmol/L PMSF），置冰上 20 min 后，離心半徑 50 mm，12 000 r/min，離心15 min，取上清液。用BCA 測定蛋白濃度后調節至統一濃度。取20 μg 蛋白樣品（12%SDSPAGE，5%脫脂奶粉；90 V，轉膜 60 min）室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜兔抗Wnt-3α、β-catenin 多克隆抗體，TBST 洗膜 3 次，10 min/次，二抗室溫孵育 1 h（二抗：山羊抗兔 1∶8000），TBST 洗膜 3 次，10 min/次，用Western blot印跡法觀察并進行半定量分析。條帶采用ImageJ 軟件進行灰度值分析。

1.3.8 免疫組化實驗 取收集到的DRG，將DRG放入4℃4%多聚甲醛中固定6 h，再放入30%蔗糖4℃過夜，然后將組織包埋成石蠟塊，切片、爬片、脫臘后按照免疫組化試劑盒（中杉金橋）進行免疫組化。在倒置顯微鏡下觀察c-fos蛋白表達情況。

1.4 統計學方法采用SPSS 21.0 軟件進行數據統計分析，計量資料以表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05表示有統計學意義。

2 結果

2.1 機械痛閾行為測試結果顯示，5 組大鼠痛閾基礎值比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。假手術組MWT隨時間無明顯變化，其他各組MWT在術后5 天持續下降，隨后出現回升趨勢；聯合治療組下降幅度最小，而上升幅度最大。與假手術組相比，其他各組MWT 在術后均顯著低于假手術組（P＜0.05）。與模型組相比，各治療組MWT 在術后下降幅度較小，而上升幅度較大。見表3。

表3 各組大鼠機械痛閾值比較（）

表3 各組大鼠機械痛閾值比較（）

注：*表示與假手術組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；▲表示與本組造模后1天比較，P＜0.05

組別假手術組模型組青藤堿組脈沖射頻組聯合治療組術后14 d 16.26±1.54 7.38±0.08*▲8.46±0.30*#9.31±1.23*#10.25±1.89*#鼠數6 6 6 6 6術前1 d 15.82±0.89 16.15±0.21 15.91±1.05 15.75±1.23 16.06±0.88術后1 d 15.53±0.12 9.35±0.25*9.41±0.09*9.49±0.28*9.58±0.87*術后3 d 14.5±0.74 8.21±0.56*8.56±0.05*8.86±0.47*9.01±0.92*#術后5 d 15.15±1.06 7.20±0.36*▲7.79±0.14*▲8.16±0.85*▲8.32±0.96*#▲術后7 d 15.83±1.05 7.31±0.58*▲7.82±0.24*▲8.31±0.85*#▲8.51±1.23*#

2.2 TNF-α、IL-1β mRNA表達與假手術組比較，模型組IL-1β、TNF-α mRNA 相對表達量顯著升高，并隨時間的加長逐漸升高；與模型組比較，各治療組IL-1β、TNF-αmRNA 表達隨著治療時間的增長而顯著降低，聯合治療組下降幅度最大。按照不同治療時長分類，發現在手術后3 天各組間IL-1β、TNF-α 基因相對表達量差異不顯著（P＞0.05）；在第 7 天時除模型組外，各治療組 IL-1β、TNF-α 基因相對表達量開始下降；14 天下降更為顯著，其中聯合治療組表達量下降最為顯著。見圖1。

2.3 c-fos 蛋白表達與假手術組比較，模型組c-fos 蛋白相對表達量明顯升高，并隨時間的增長逐漸升高；與模型組比較，各治療組c-fos 蛋白相對表達量隨著治療時間的增長而顯著降低，其中在同一時間青藤堿組下降幅度最小，聯合治療組下降幅度最大。見圖2—3。

圖1 各組脊髓背根神經節中TNF-α、IL-1β mRNA的相對表達量比較

圖2 脊髓背根神經節中c-fos蛋白的相對表達

圖3 各組脊髓背根神經節中c-fos蛋白的相對表達比較

2.4 Wnt-3α、β-catenin 蛋白表達與假手術組比較，模型組Wnt-3α、β-catenin 蛋白表達量均顯著升高（P＜0.05），但隨時間的加長差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組相比，各治療組Wnt-3α、β-catenin 蛋白表達量均隨時間增長而顯著下降（P＜0.05），其中在同一時間下聯合治療組下降幅度最大。見圖4—5。

圖4 脊髓背根神經節中Wnt-3α、β-atenin蛋白的相對表達

圖5 各組脊髓背根神經節中Wnt-3α、β-catenin蛋白的相對表達比較

3 討論

NP 是由于神經系統受到損傷或產生病變而引起的疼痛［18］，通常定義為由外周或中樞神經疾病及損傷引起的慢性疼痛綜合征，其主要特征有痛覺過敏、自發性痛及異常痛［19-20］。由于NP 的發病機制復雜、難以治愈、患病率高等，人們將其稱為“不死的癌癥”，聯合用藥是目前比較有效的治療NP 的途徑［21-22］。青藤堿通常被用于抗炎止疼［23］，脈沖射頻對神經疼痛的治療具有顯著的效果［24］。因此，本研究通過構建SNL 持續性術后疼痛大鼠模型，利用青藤堿、脈沖射頻治療法及兩者聯合治療法3 種方法進行治療，觀察青藤堿聯合脈沖射頻治療法通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路對大鼠SNL 后神經痛的治療效果。MWT 評價治療結果發現，青藤堿聯合脈沖射頻療法治療NP 的效果最佳。

神經疼痛是神經炎癥的主要特征，是一種周圍或中樞神經系統的局部炎癥［25］。本研究結果顯示，大鼠SNL 模型組中與NP 有關的炎性因子IL-1β、TNF-α mRNA相對表達量顯著升高，并隨時間的加長逐漸升高；與模型組相比，各治療組IL-1β、TNF-α mRNA 表達隨著治療時間的增長而顯著降低，而聯合治療組脊髓背根神經節中TNF-α、IL-1βmRNA 的表達顯著低于其他各組。提示NP 的產生和維持可能與炎癥因子過表達密切相關，聯合治療組能有效的抑制炎癥因子的合成與釋放，從而緩解NP 的維持。進一步研究發現各治療組脊髓背根神經節中c-fos 蛋白的表達隨著時間的增長而降低，其中聯合治療組下降的幅度最大，提示青藤堿聯合脈沖射頻療法能有效的緩解NP 的發展與維持。

本研究檢測了SNL大鼠背根神經節中Wnt/βcatenin 信號通路相關因子 Wnt-3α 和β-catenin蛋白的表達情況，發現大鼠SNL 模型組中Wnt-3α和β-catenin 蛋白的相對表達量顯著升高；與模型組相比，各治療組Wnt-3α 和β-catenin 蛋白的相對表達顯著降低，而聯合治療組脊髓背根神經節中Wnt-3α 和β-catenin 蛋白的相對表達顯著低于其他各組。提示Wnt/β-catenin 信號通路在神經損傷大鼠背根神經節中被廣泛激活，可能與NP 的產生和維持有關；聯合治療組能有效的抑制Wnt/β-catenin 信號通路相關因子 Wnt-3α 和βcatenin 蛋白的相對表達。Wnt/β-catenin 信號轉導通路是一條在生物進化中極為保守的通路［4］，但是當細胞外 Wnt 信號被激活后，Wnt 配體與富含半胱氨酸的卷曲區域受體和FZ 供受體結合，使細胞質中β-catenin 積累起來，從而激活細胞內的信號級聯和目的基因的轉錄。以上提示，青藤堿聯合脈沖射頻法可能通過調節富含半胱氨酸的卷曲區域受體和FZ供受體，抑制Wnt的活性、使β-catenin 降解，從而影響神經損傷后NP 的發生發展過程。

綜上所述，青藤堿聯合脈沖射頻療法能顯著降低SNL大鼠背根神經節中炎癥相關因子和c-fos的表達及Wnt/β-catenin 信號通路相關蛋白的表達，從而的緩解SNL 大鼠神經痛，提示青藤堿聯合脈沖射頻療法通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路相關蛋白的表達，可影響炎癥因子和c-fos 的表達而參與NP的發生發展，從而緩解SNL大鼠疼痛。