白刺果作用于白血病NB4 細胞的機制研究*

王 燕，謝親建，馬弢業，丁曉煜，王愛昕，潘 銘

1 武威市人民醫院,甘肅 武威 733000；2 武警甘肅省總隊醫院；3 蘭州大學藥學院；4 西北民族大學第二附屬醫院

白血病是一種骨髓干細胞無限增殖的克隆性疾病，俗稱為血癌。主要癥狀為流鼻血、面部蒼白、食欲減退等。隨著經濟條件的發展和醫療技術的改變，學者對白血病的研究越來越多。白血病大致分為慢性和急性兩種［1-2］，急性白血病多發生于兒童，而且發病率逐年上漲，根據國際治療白血病的規劃方案，治療白血病的藥物極少，且此病容易耐藥，治愈率較低。以前人們無論用化學合成、物理提取的藥物，還是從生物學的角度改變基因蛋白等，都無法從根本上治療白血病。白刺果（Nitraria L.）常被用來治療胃部不適等癥狀?，F代藥理學研究表明，白刺果對胃癌具有治療作用?；诖?，我們從分子生物學的角度研究白刺果對白血病細胞NB4 的影響，了解其對白血病細胞的抑制作用，為臨床診斷提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 試藥與試劑白刺果采摘于騰格里沙漠，經蘭州大學生藥學研究所馬志剛教授鑒定為蒺藜科白刺屬的灌木果實；小牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批號：22011-8612）；RPMI1640 培養基（Hyclone，SH30809.01）；NB4 細胞株（蘭州大學藥學院惠贈）；陽性對照藥物亞砷酸鈉注射液（哈爾濱醫大藥業股份有限公司，國藥準字H19990191）。

1.2 儀器Sartorius 分析天平（SARTORIUSBT23S）；Thermo CO2培養箱（thermo-scientific公司）；Multiskan Spectrum 酶標儀（美國 Thermo Scientific公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 白刺果的制備 取白刺果500 g，清水沖洗、曬干；放入燒瓶，加入純水500 mL，煎煮3次，每次1 h，蒸餾，合并濾液，比重為1.025～1.030 g/mL，待用。

1.3.2 細胞培養與MTT 檢測 將凍存的白血病細胞株NB4 在37℃水浴中迅速融化，加入3 mL 培養液吹打后放入10 mL離心管中，離心半徑：10 cm，1000 r/min，離心5 min，棄去上清液，用含有10%胎牛血清、雙抗（100 U/mL 青霉素、100 U/mL 鏈霉素）的培養基中，在37℃，5%CO2培養箱中培養，整個過程在無菌環境中操作。取對數生長期的白血病細胞株NB4，用含10%小牛血清的RPM1640 培養液調整細胞密度至2.0×105/mL，接種至96 孔培養板，每孔100 μL。等待2 h 后，分別加入不同濃度（5、10、20、40 μg/mL）的白刺果浸取液100 μL，每個濃度設3個孔，并設對照組。分別于培養12、24、36 h 后每孔加入 5 mg/mL 的 MTT 試劑 10 μL，繼續培養4 h，棄上清液，加三聯液，用酶聯免疫檢測儀以570 nm測量波長測定各孔吸光度（A），按以下公式計算：

抑制率（%）=（對照組-給藥組）／對照組

1.3.3 PI 檢測細胞周期 將白血病細胞株NB4調整至 2.0×105個/mL，接種于 6 孔板，每孔 3 mL。4 h后加入不同濃度的白刺果浸取液，每孔加入藥物后終體積為1000 μL。培養24 h 后，收集細胞，離心半徑：10 cm，1000 r/min，離心5 min，棄上清。預冷PBS 重懸細胞，離心洗滌3 次，用體積分數為70%的乙醇5℃固定過夜。上機前用PBS 溶液洗滌，加入PI 染色液（含RNA 酶5 mg/mL），終濃度為500 μg/mL，避光染色15～20 min，300 目尼龍網過濾后上流式細胞儀分析細胞DNA含量的變化。

1.3.4 免疫印跡法檢測凋亡蛋白的表達 取對數生長期白血病NB4細胞，調整細胞密度為2.0×105個/mL，接種于 6 孔板，每孔 4 mL，30 min 后加入白刺果進行干預，作用24 h后收集細胞，每組細胞裂解液，于冰上裂解 25～30 min，12 000 r/min 離心后棄沉淀，收集上清，保存于-20℃備用。后續將分離的蛋白經過轉膜，封閉，孵育，抗體的稀釋比例分別為細胞色素c（Cytochrome C，Cmy-c）（1∶500），B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）（1∶500），Caspase-3 家族（Pro-caspase3）（1∶500），β-actin（1∶500），一抗在 4℃的冰箱中孵育過夜，洗滌2 次，孵育二抗，再洗滌2 次，采用ECL發光液，采用膠片曝光形式。

1.4 統計學方法采用Excell 2007 錄入數據，采用一般描述性分析。

2 結果

2.1 白血病NB4 細胞周期白刺果對白血病的抑制周期發生在G1期，這與三氧化二砷抑制白血病細胞的周期相一致。白刺果、三氧化二砷作用于白血病細胞凋亡顯示，當白刺果和三氧化二砷的濃度為5 μg/mL時，抑制率分別為5.66%和47.6%；當白刺果和三氧化二砷的濃度為10 μg/mL 時，抑制率分別為25.68%和32.26%，相同濃度的白刺果對白血病細胞的抑制率低于三氧化二砷。見圖1。

2.2 白血病NB4 細胞抑制率白刺果對白血病NB4 細胞具有抑制作用，隨著時間的延續或濃度的遞增，對白血病細胞的抑制率增高，當濃度為20 μg/mL時，抑制細胞的程度趨于平衡，這可能是細胞的增殖太快，藥物濃度降低的緣故，另外，相同濃度的不同時間節點，藥物作用的整個過程中，時間越長，抑制白血病細胞的效果越好，且抑制程度與濃度和時間具有正相關性。見圖2。

2.3 白血病NB4 細胞凋亡蛋白的分析白刺果可以激活線粒體途徑，對Cmy-c 或Bcl-2 起作用，隨著濃度的升高，蛋白的表達下降見圖3。

圖1 對白血病細胞NB4細胞周期的影響

圖2 不同濃度白刺果對白血病細胞NB4的抑制率

3 討論

每年大約有18.5%的人死于白血病，近年來白血病的患病人群逐漸年輕化［3-6］。

通過本次實驗和前期的研究可知，藥物對細胞的抑制先是通過對細胞周期的調控［7-8］，細胞周期是任何一種細胞生命的特征，細胞周期也是發生惡性血液循環的主要原因之一；其次，藥物對細胞的抑制是通過Caspase家族和Bcl-2家族系統，通過激活Pro-Caspase 途徑，再進一步激活線粒體途徑，從而阻斷細胞的生長繁殖，達到抑制的效果，也就是促進了細胞的凋亡。白刺果抑制白血病NB4 細胞正是通過線粒體途徑降低Cmy-C 和Bcl-2 蛋白的含量。另外，從白刺果的成分可知，白刺果中含有大量的黃酮化合物，黃酮化合物能夠抑制調控細胞周期［9］，凋亡誘導腫瘤細胞，抑制細胞增殖，對于血液系統疾病來說，可調節血液細胞，影響血管生成［10-12］。基于此，白刺果對白血病的治療作用，可能是黃酮類化合物在起重要作用，至于哪種黃酮類化合物起作用，有待于進一步研究。

圖3 對白血病細胞NB4凋亡蛋白的影響