早期針刺對(duì)顱腦損傷大鼠神經(jīng)功能和Cleaved Caspases-3的影響*

杜若桑 張曉輝 柳依江 鄭淑美 崔 海

（首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069）

顱腦損傷（TBI）是指外力導(dǎo)致的腦部結(jié)構(gòu)或功能上的損傷。在工業(yè)化社會(huì)中它是青年人的主要死因之一［1］。TBI發(fā)生后常因細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、血腦屏障破壞、氧化應(yīng)激、興奮性毒性等病理改變導(dǎo)致繼發(fā)性損傷［2-4］。針灸對(duì)TBI的療效已被諸多臨床和動(dòng)物研究證實(shí)［5-7］。本研究擬觀察針刺對(duì)TBI大鼠腦皮質(zhì)內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspases-3蛋白表達(dá)、腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)和運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)等神經(jīng)功能的影響來(lái)探討針刺對(duì)TBI的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)6～7周齡雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量200～240 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。于首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心分籠飼養(yǎng)，溫度（25±2）℃，于光照、黑暗周期各12 h的恒溫恒濕環(huán)境，自由攝食和飲水。

1.2 儀器與試劑

精密顱腦損傷撞擊器PCI3000（美國(guó)Hatteras instruments公司），68025型腦立體定位儀（深圳瑞沃德生命技術(shù)有限公司），華佗牌一次性無(wú)菌針灸針（0.30 mm×13 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），7750型Rotarod大鼠轉(zhuǎn)棒儀（意大利UgoBasile公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo），VE186轉(zhuǎn)移電泳槽（上海天能科技有限公司），Cleaved Caspase-3抗體（美國(guó)CST公司，9661T），ECL發(fā)光液（美國(guó)Millipore公司，WBKLS0500），BCA蛋白定量試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，02912E），蛋白酶抑制劑（瑞士羅氏公司，04693116001），Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（美國(guó)Jackson公司，111-035-003），Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（美國(guó)Jackson公司，115-035-003）。

1.3 分組及造模

1）動(dòng)物分組：適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組、針刺組，每組各10只。模型組和針刺組制備TBI模型。假手術(shù)組僅開(kāi)骨窗不進(jìn)行打擊，空白組不進(jìn)行任何處理。2）模型制備：將10%水合氯醛溶液腹腔注射以麻醉大鼠（0.4 mL/100 g），大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀，在大鼠眼睛后方沿正中線做長(zhǎng)約1.5 cm的縱形切口，暴露出前囟。隨即在前囟向右旁開(kāi)2.5 mm，向后1.5 mm處為圓心，用顱鉆鉆出直徑約6 mm的圓形骨窗，保持硬腦膜完整。隨后應(yīng)用PCI3000撞擊器（打擊參數(shù)設(shè)置為撞擊頭直徑為4 mm，打擊速度為4 m/s，打擊深度為 2 mm，停留時(shí)間 100 ms）撞擊此處造成 TBI［8］，最后清理創(chuàng)口，將骨瓣還納于骨窗中，用組織膠水封閉，最后縫合頭皮。

1.4 干預(yù)方法

針刺組大鼠在造模完成后即接受針刺：針刺大鼠水溝、風(fēng)池（雙側(cè)）、內(nèi)關(guān)（雙側(cè)）、足三里（雙側(cè)），穴位定位依據(jù)華興邦等制定的大鼠穴位圖譜［9］。水溝穴向上斜刺1 mm，捻轉(zhuǎn)10 s后出針。風(fēng)池直刺3 mm，內(nèi)關(guān)直刺1～2 mm，足三里直刺3～5 mm，3穴行平補(bǔ)平瀉手法后留針20 min。造模術(shù)后即進(jìn)行針刺治療，治療每日1次，共治療7 d。假手術(shù)組、模型組和空白組均給予同樣的抓取、固定，每日1次，但不進(jìn)行任何治療。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.5.1 改良的神經(jīng)功能評(píng)分（mNSS） 分別于治療第2天、第4天和第7天應(yīng)用mNSS評(píng)分表評(píng)估大鼠神經(jīng)功能：分別從運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)（視覺(jué)、觸覺(jué)、本體覺(jué)）、平衡、反射4方面進(jìn)行評(píng)估。總分18分，評(píng)分越低代表神經(jīng)功能損傷程度越輕。1～6分為輕度損傷，7～12分為中度損傷，13～18分為重度損傷［10］。

1.5.2 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)（Rotarod test） 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)大鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)和平衡能力［11］。造模前3 d進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，治療前1 d、治療第2天、第4天和第7天進(jìn)行轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)。測(cè)試時(shí)將大鼠放置在轉(zhuǎn)棒儀上，轉(zhuǎn)棒儀設(shè)置為加速模式：5 min內(nèi)轉(zhuǎn)速由4 r/min勻速增加至40 r/min，啟動(dòng)儀器后大鼠如果從轉(zhuǎn)棒上掉落或抱住轉(zhuǎn)棒旋轉(zhuǎn)2圈均為測(cè)試解釋，記錄大鼠在轉(zhuǎn)棒儀上停留的時(shí)間，每只大鼠進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，取其平均值作為本實(shí)驗(yàn)最終數(shù)據(jù)。數(shù)值越低表明大鼠損傷程度越重。結(jié)束第7天治療后完成mNSS評(píng)分和Rotarod test，然后將大鼠麻醉取腦，在造模損傷局部的中心、與大鼠身體長(zhǎng)軸垂直切分為兩部分：一部分置于盛有4%多聚甲醛的EP管中常溫固定24 h以備HE染色法檢測(cè)；另一部分存放于-80℃冰箱待Western blotting檢測(cè)。

1.5.3 HE染色法觀察大鼠腦組織形態(tài)表現(xiàn) 在腦組織上切取厚約4 mm左右的標(biāo)本，進(jìn)行石蠟包埋，蠟塊經(jīng)切片、脫蠟，蘇木素-伊紅（HE）染色，脫水，透明和中性樹(shù)膠封片后成片，光鏡下放大200倍觀察。

1.5.4 Western blotting法檢測(cè)損傷腦組織Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá) 取損傷周圍腦組織50 mg，加200 μL RIPA裂解液后，勻漿10 min離心20 min，取上清進(jìn)行蛋白定量及蛋白樣本制備。根據(jù)目的蛋白的分子量，配制10%分離膠，濃縮膠濃度為5%。電泳后用電轉(zhuǎn)膜儀將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完成后用麗春紅染色試劑對(duì)膜進(jìn)行染色，將膜完全浸沒(méi)于5% BSA-TBST中封閉，水平搖床孵育1 h。5% BSA-TBST稀釋一抗，4℃水平搖床孵育過(guò)夜。次日孵育二抗，TBST洗膜3次每次10 min。將ECL滴加到膜的蛋白面，顯影2 min后定影。置于成像儀中采集圖像，使用Gel Image ststem ver.4.00（上海天能科技有限公司）分析條帶灰度值，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值計(jì)算出目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（）表示。符合正態(tài)分布且方差齊時(shí)，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法；方差不齊則采用Welch法，組間比較采用Dunnett′T3法。數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布的進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組mNSS評(píng)分比較

見(jiàn)表1。假手術(shù)組與空白組大鼠mNSS評(píng)分相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。術(shù)治療第2、4、7天時(shí)，模型組大鼠評(píng)分均顯著高于假手術(shù)組和空白組（均P＜0.01）。治療第2天針刺組和模型組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但治療第4和7天時(shí)，針刺組評(píng)分低于模型組（均P＜0.05）。

表1 各組大鼠mNSS評(píng)分比較（分，±s）

表1 各組大鼠mNSS評(píng)分比較（分，±s）

注：與假手術(shù)組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組別空白組假手術(shù)組模型組針刺組n 10 10 10 10 2 d 0.20±0.42 0.60±0.84 11.00±2.45△△8.10±2.13 4 d 0.10±0.32 0.20±0.42 7.60±2.27△△5.00±1.15*7 d 0 0.1±0.32 5.80±1.87△△3.40±1.17*

2.2 各組Rotarod test評(píng)分比較

見(jiàn)表2。假手術(shù)組與空白組大鼠轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）術(shù)前各組無(wú)差異（P＞0.05）。治療第2、4、7天時(shí)，模型組大鼠評(píng)分均著低于假手術(shù)組（P＜0.05或P＜0.01），與模型組相比，針刺組在治療第4、7天評(píng)分明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各組大鼠Rotarod test評(píng)分比較（分，±s）

表2 各組大鼠Rotarod test評(píng)分比較（分，±s）

組別空白組假手術(shù)組模型組針刺組n 10 10 10 10-1 d 161.40±70.00 155.10±52.46 174.10±38.71 163.30±75.99 2 d 158.00±81.45 152.50±46.72 83.30±20.83△△94.50±37.63 4 d 168.90±76.55 160.50±47.50 91.60±20.49△△149.70±44.61*7 d 177.00±67.84 158.20±50.87 103.30±37.20△179.50±57.41**

2.3 各組大鼠腦組織形態(tài)表現(xiàn)

見(jiàn)圖1。空白組和假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)細(xì)胞排列均勻，胞核染色為藍(lán)色，可見(jiàn)核仁，胞漿粉紅，輪廓清晰。模型組和針刺組有出血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核固縮、碎裂明顯；組織空泡樣改變明顯，腦組織結(jié)構(gòu)紊亂；壞死周圍出現(xiàn)纖維增生和瘢痕組織。針刺組還可觀察到正常神經(jīng)元，組織疏松和紊亂輕于模型組，修復(fù)情況好于模型組。

圖1 各組大鼠腦組織的病理變化（HE染色，200倍）

2.4 各組大鼠腦皮質(zhì)內(nèi)Cleaved Caspases-3蛋白表達(dá)水平的比較

見(jiàn)表3。假手術(shù)組與空白組大鼠Cleaved Caspases-3蛋白表達(dá)相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組大鼠Cleaved Caspases-3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于假手術(shù)組、空白組（P＜0.01），針刺組表達(dá)量低于模型組（P＜0.01）。

表3 各組大鼠腦組織Cleaved Caspases-3相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表3 各組大鼠腦組織Cleaved Caspases-3相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

組別空白組假手術(shù)組模型組針刺組n 10 10 10 10相對(duì)表達(dá)量0.37±0.18 0.39±0.14 1.31±0.47△△0.84±0.11**

3 討論

Caspase家族是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素，其促凋亡作用可發(fā)生在細(xì)胞凋亡的各個(gè)時(shí)期［12-13］。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同，Caspase家族可被分為凋亡的啟動(dòng)者和執(zhí)行者。Caspase-3屬于后一種，它是該家族最重要的蛋白酶，是多種凋亡刺激信號(hào)傳遞的匯集點(diǎn)和凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)共同下游的必經(jīng)通路，總之是凋亡關(guān)鍵的執(zhí)行者［13-14］。凋亡早期，內(nèi)源性通路和外源性途徑聯(lián)合將Procaspases-3剪切成具有活性的Cleaved Caspases-3，繼而推動(dòng)凋亡進(jìn)程，即Cleaved Caspases-3是Caspase-3的活化形式［15-17］。

細(xì)胞凋亡是TBI后腦損傷的機(jī)制之一，損傷后興奮性毒性、細(xì)胞內(nèi)鈣超載和自由基均可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生［18-19］。Caspase-3在TBI后細(xì)胞凋亡中起到重要作用，此時(shí)非活性狀態(tài)的Procaspase-3被剪切活化，隨后導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡和腦組織損傷［20］。另有臨床研究［21］發(fā)現(xiàn)重型TBI患者血清Caspase-3水平明顯高于對(duì)照組，死亡組血清Caspase-3水平明顯高于存活組；因Caspase-3與TBI嚴(yán)重程度密切相關(guān)，由此Caspase-3水平可作為患者預(yù)后的判斷因素之一。研究發(fā)現(xiàn)TBI傷后4 h Cleaved Caspases-3主要表達(dá)在和胼胝體相鄰的大腦皮質(zhì)中，但傷后24 h就廣泛分布于受傷皮質(zhì)的整個(gè)區(qū)域內(nèi)［22］。YANG等［23］觀察了傷后72 h內(nèi)的Cleaved Caspase-3的變化：傷后6 h表達(dá)增高，12 h時(shí)達(dá)到峰值，隨后開(kāi)始下降。杜勇等發(fā)現(xiàn)相對(duì)于假手術(shù)組，TBI模型組24 h時(shí)Cleaved Caspases-3在腦內(nèi)表達(dá)上升，伴隨著B(niǎo)cl-2（Bcl-2是抑制細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)因子）蛋白相對(duì)表達(dá)量的顯著降低、腦水腫和神經(jīng)功能損傷的表現(xiàn)［24］。

針灸治療TBI具有多途徑多靶點(diǎn)的特征，起效機(jī)制多樣，抑制細(xì)胞凋亡即是針灸起效機(jī)制之一［25］。如針刺可調(diào)節(jié)凋亡調(diào)節(jié)因子P53、Bax和Bcl-2的表達(dá)：張毅敏等［26-27］研究發(fā)現(xiàn)針刺水溝、百會(huì)等穴可使TBI大鼠腦組織中P53和Bax表達(dá)降低，Bcl-2升高，最終減少細(xì)胞凋亡，因P53和Bax能加速凋亡，而B(niǎo)cl-2后者可抑制凋亡。另有研究發(fā)現(xiàn)電針可降低TBI大鼠海馬CA1區(qū)中Caspase-3的表達(dá)，并伴隨著認(rèn)知功能的改善［28］。

根據(jù)中醫(yī)理論，TBI病因病機(jī)是頭部受到外力撞擊，血溢脈外，氣滯血瘀，神志昏蒙，經(jīng)絡(luò)瘀阻。本研究選用了水溝、風(fēng)池、內(nèi)關(guān)、足三里治療TBI。據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)此4穴均是臨床上針灸治療TBI的高頻用穴［29］。其中水溝和風(fēng)池位于頭面頸部，而TBI病位在頭腦，二穴靠近病變所在：水溝屬督脈，督脈“入屬于腦”，針刺水溝可開(kāi)竅、醒神、蘇厥；風(fēng)池可醒腦開(kāi)竅，疏調(diào)頭部氣機(jī)。內(nèi)關(guān)和足三里位于四肢，可疏通肢體經(jīng)絡(luò)，治療TBI所致肢體功能障礙。另外內(nèi)關(guān)屬心包經(jīng)，心主神志、神志，可調(diào)理心氣、寧心安神，促進(jìn)氣血運(yùn)行。足三里屬足陽(yáng)明胃經(jīng)，脾胃為后天之本，氣血生化之源，本穴可補(bǔ)益氣血，強(qiáng)身健體。

因WB技術(shù)是檢測(cè)蛋白表達(dá)特定且靈敏的方法，本研究利用此技術(shù)檢測(cè)了腦皮質(zhì)內(nèi)Cleaved Caspases-3蛋白表達(dá)水平，結(jié)果再一次證實(shí)了TBI后大鼠腦組織內(nèi)Cleaved Caspases-3的表達(dá)增多，并伴有神經(jīng)功能損傷和腦組織結(jié)構(gòu)損傷的表現(xiàn)。神經(jīng)功能損傷是利用mNSS評(píng)分和Rotarod test評(píng)分來(lái)評(píng)估，因前者可從運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、平衡、反射4方面對(duì)大鼠神經(jīng)功能做出綜合全面評(píng)估［10］，而后者能進(jìn)一步更客觀地評(píng)估大鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)和平衡能力［11］。腦組織結(jié)構(gòu)損傷是通過(guò)HE染色觀察得來(lái)，因HE染色技術(shù)是目前組織學(xué)、病理學(xué)等最常用的技術(shù)方法之一，它以不同顏色顯示細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，可以直觀地顯示出腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，通過(guò)它可觀察到組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。而經(jīng)過(guò)針刺治療后，大鼠腦皮質(zhì)中Cleaved Caspases-3表達(dá)有明顯下降，腦組織形態(tài)學(xué)損傷減輕；并在針刺治療后第4天和第7天mNSS評(píng)分和Rotarod test評(píng)分優(yōu)模型組，這意味著大鼠活動(dòng)、感覺(jué)等行為學(xué)表現(xiàn)改善明顯。本研究說(shuō)明針刺可以通過(guò)抑制Cleaved Caspases-3的表達(dá)，減輕細(xì)胞凋亡達(dá)到修復(fù)腦組織和保護(hù)神經(jīng)功能的療效。而針刺通過(guò)何種信號(hào)通路或路徑抑制Caspases-3則需要進(jìn)一步的研究。