氮素形態對不同茬次紫花苜蓿氮素積累及利用的影響

劉文濤，王玉強，孫盛楠，趙 儀，沈 宇，錢 進，嚴學兵

（1. 揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009；2. 教育部農業與農產品安全國際合作聯合實驗室，江蘇 揚州 225009）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是廣泛栽培利用的豆科牧草，關于紫花苜蓿的生產中是否需要施氮以及施氮對其的影響一直存在爭議。以往大量研究表明，適量施氮可以提高紫花苜蓿產量和地上地下累積生長量[1-3]，提高紫花苜蓿氮代謝關鍵酶活性并增加其氮素積累量[4]。也有研究指出，施氮對紫花苜蓿生長和生物量沒有顯著影響[5-6]，甚至是無益的[7]。有學者分析造成這種分歧的原因主要有研究地點不同(土壤、水分、溫度等條件不同)、研究方法不同(盆栽試驗、大田試驗)、研究年限不同(月動態、年動態)等[8]。實際上，肥料種類和氮素形態也是造成紫花苜蓿對氮素添加有不同響應的原因。在施氮的研究中，常用的氮肥有尿素[3,9-11]、硝酸鈣、硫酸銨[4,12]、硝酸銨、硝酸鈉、氯化銨[13]等。使用不同種類、濃度及不同配比的氮肥會對植物的生長產生不同甚至相反的影響。

氮素形態是影響植物生長發育的重要因素，它通過調控植物的光合作用與呼吸作用，以及根系吸收礦質元素等過程，進而影響植物的生長和發育。我國是氮肥消費大國，在農業生產實踐中，氮肥常包含兩種形態：銨態氮和硝態氮，這是植物可以吸收和利用的主要無機氮形式[14]。研究者已發現氮素形態的重要性，并在大量對農作物和經濟作物的施氮研究中區分不同氮素形態的作用。如對玉米(Zea mays)[15-16]、歐洲羽扇豆(Lupinus angustifolius)[16]、水稻(Oryza sativa)[17]、小麥(Triticum aestivum)[18]等的研究。一般來講，旱地植物喜硝，水淹土種植的作物喜銨。有研究認為硝態氮能夠促進植物光合碳同化和蔗糖的積累，對莖葉生長和調控葉片老化也有積極作用，而銨態氮能夠促進植物葉片中淀粉的積累，提高植物的光合能力，但是銨態氮過多也會導致植物代謝失調，發生“銨中毒”[14,19-20]。Ashton 等[21]指出，不同植物物種喜好不同氮素形態，植物對不同形態氮素的吸收和利用具有可塑性。相較于眾多關注氮素形態對作物生長影響的研究，僅有少數學者關注氮素形態對紫花苜蓿生長及氮素利用率等的影響[4,12]，限于紫花苜蓿品種、地區氣候條件差異等因素，這方面的研究還有待完善。鑒于此，本研究以紫花苜蓿為試驗材料，分析不同形態氮素對紫花苜蓿氮含量、氮素積累量以及氮素利用率的影響，旨在探索不同形態氮肥在紫花苜蓿生產中的應用，為人工種植紫花苜蓿合理施氮、提高其生產性能提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫花苜蓿(WL440HQ) 購于北京正道生態科技有限公司，秋眠級6 級。供試氮肥為硝酸鈉(NaNO3，16% N)和氯化銨(NH4Cl，26% N)。

1.2 試驗設計

本試驗在揚州大學草學智能溫室中進行，溫室一樓為種植區，土壤為重壤土。選取1.5 m × 1.5 m質地相似的16 個小區，采用完全隨機設計，設置4 個處理，分別為對照組 (N0，不施氮)、單施NaNO3組()、 單 施NH4Cl 組 () 以 及NaNO3和NH4Cl 1 ∶ 1 混施組(Nmix)，每個處理4 個重復。

1.3 試驗方法

2019 年4 月底對試驗小區進行翻耕、除雜等處理，測定土壤基礎養分：有機質含量12.62 g·kg-1，全氮含量0.78 g·kg-1，銨態氮含量12.36 mg·kg-1，硝態氮含量8.38 mg·kg-1，速效磷含量35.42 mg·kg-1，速效鉀含量72.5 mg·kg-1，pH 8.13。5 月初進行條播，行距15 cm，播種深度2 cm。施氮量按純氮計200 kg·hm-2，分3 次，在播種期、第1 次刈割后、第2 次刈割后分別以液態施入。苗期每周利用溫室自動噴淋裝置進行人工降雨1 次。期間進行日常除雜，保持通風。種植當年于初花期刈割，共刈割3 次。每次刈割后取植物根際0 - 20 cm 土壤，去除細根等雜物，帶回實驗室進行分析。

1.4 測定指標

土壤有機質、速效磷、速效鉀、全氮、銨態氮和硝態氮含量測定參照《土壤農化分析》[22]；植物株高即測自然狀態下植株的自然高度；挖出植物完整根系，測定根系長度，以及地上和地下部分鮮重。植物根及葉片中硝態氮和銨態氮含量采用試劑盒測定(購于蘇州科銘生物科技有限公司)。氮素積累量、氮素吸收效率(nitrogen uptake efficiency, NUPE)和氮肥利用率的計算方法如下[23]：

氮素積累量(kg·hm-2) = 干物質 × 含氮量；

氮素吸收效率 = 植株氮素積累量/施氮量 × 100%；

氮肥利用率 = (施氮處理植株地上部氮含量 -不施氮處理植株地上部含氮量)/施氮量 × 100%。

1.5 數據處理

利用Microsoft Excel 2010 對原始數據進行整理。采用SPSS 19.0 對數據進行分析，對不同形態氮素對紫花苜蓿生長特征、氮含量、氮素積累量、氮素吸收率、氮肥利用率和土壤理化指標的影響進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan 法進行多重比較，相關分析采用Pearson 系數。使用Sigma plot 14.0 作圖。

2 結果與分析

2.1 不同形態氮素對不同茬次紫花苜蓿根際土壤化學性質的影響

圖 1 不同形態氮素對不同茬次紫花苜蓿根際土壤化學性質的影響Figure 1 Effects of different nitrogen forms on soil chemical properties of alfalfa rhizosphere in different stubbles

添加不同形態氮素對不同茬次紫花苜蓿根際土壤有機質含量影響不顯著(P ＞ 0.05)，隨著刈割茬次增加，混合施氮下的土壤有機質含量逐漸降低，在第2 和3 茬時均低于對照組處理。在刈割前兩茬時，各處理間土壤pH 沒有顯著變化(P ＞ 0.05)，在第3 茬時，單施硝態氮處理的pH 顯著高于其他3 組的，單施銨態氮處理下的土壤pH 最低(P ＜ 0.05) (圖1)。在第1 茬時，施氮處理下的土壤速效磷含量均顯著高于對照組(P ＜ 0.05)，隨刈割茬次增加，只有單施銨態氮處理組的土壤速效磷顯著高于對照組，其余各處理組與對照組沒有顯著差異(圖1)。說明單施硝態氮或混施氮可能促進紫花苜蓿對磷的吸收，因此該處理下的土壤速效磷含量低于單施銨態氮處理組。除了第3 茬的單施硝態氮組外，其余各處理的土壤速效鉀含量在各個茬次都顯著高于對照組(P ＜ 0.05)，在第2 茬時，各處理下的土壤速效鉀含量最高，說明速效鉀不是限制紫花苜蓿生長的主要因素。

2.2 不同形態氮素對不同茬次紫花苜蓿植株及根際土壤氮含量的影響

不同茬次，土壤全氮含量在施氮處理組都有增高，尤其在單施銨態氮和混施氮處理組都顯著高于對照組(P ＜ 0.05) (圖2)。各施氮處理組的土壤硝態氮含量也顯著高于對照組，隨刈割茬次增加，混合施氮處理組的土壤硝態氮含量最高。與土壤硝態氮含量的變化不同，土壤銨態氮含量在不同茬次不同處理下都沒有顯著的變化(P ＞ 0.05)，這可能是施入的銨態氮被迅速轉化為硝態氮，因此土壤硝態氮含量存在明顯波動，而銨態氮含量變化不顯著。

在前兩茬混合施氮處理下的紫花苜蓿植株全氮含量最高(P ＜ 0.05)，第3 茬時，單施硝態氮處理＞紫花苜蓿植株全氮含量顯著高于其余各處理組，所有施氮處理下的植株氮含量均顯著高于對照組(P ＜0.05) (圖2)。各茬次各處理下的植株硝態氮、銨態氮含量都顯著高于對照組。其中，植株硝態氮含量在各個茬次中都是混合氮處理組最高，而植株銨態氮含量在第1 茬時，盡管各處理組的含量都顯著高于對照組(P ＜ 0.05)，但各處理間無顯著差異(P ＞0.05)。

2.3 不同形態氮素對不同茬次紫花苜蓿氮素積累及利用的影響

圖 2 不同形態氮素對不同茬次紫花苜蓿植株及根際土壤氮含量的影響Figure 2 Effects of different nitrogen forms on the nitrogen content of alfalfa rhizosphere soil in different stubbles

添加不同形態氮素在不同茬次都顯著提高了植株地上生物量，在第2 茬時，混合施氮處理組植株地上生物量顯著高于其余各處理組(P ＜ 0.05) (圖3)。通過計算添加不同形態氮素后紫花苜蓿的氮素積累量、氮素吸收率和氮肥利用率，結果顯示，第1 茬時，混合施氮下的氮素積累量、氮素吸收效率和氮肥利用率顯著高于單施銨態氮處理組(P ＜ 0.05)，第2、3 茬時混合施氮和單施硝態氮處理組顯著高于單施銨態氮處理組(圖3)，地上生物量、氮素積累量、氮素吸收效率和氮肥利用效率都是在第2 茬時高于其他兩茬。說明在刈割狀態下，紫花苜蓿在刈割第2 茬產量最高且對不同形態氮肥，尤其是對硝態氮肥和混合氮肥的吸收和利用效果較好。

圖 3 不同形態氮素對不同茬次紫花苜蓿氮素積累及利用的影響Figure 3 Effects of nitrogen forms on the nitrogen accumulation and use efficiency of alfalfa in different stubbles

圖 4 不同茬次紫花苜蓿生物量和氮含量的主成分分析Figure 4 PCA of the biomass and nitrogen content of alfalfa in different stubbles

通過主成分分析對不同茬次紫花苜蓿地上生物量、氮含量進行聚類(圖4)，沿第1 軸方向，添加不同形態氮素處理對紫花苜蓿的生長和氮素積累有明顯的影響，各處理組明顯區別于對照組，且單施硝態氮處理組和混施氮處理組的樣點分布較集中，說明這兩種處理對紫花苜蓿生長、氮素積累的影響相似，但是與單施銨態氮處理組不同。主成分分析第1 軸解釋了不同茬次各處理間95.8%的紫花苜蓿生長和氮含量變化，第2 軸解釋了3.7%的變化。

2.4 紫花苜蓿氮素積累與土壤因子的關系

相關分析結果表明(圖5)，第1 茬時，紫花苜蓿氮素積累量與土壤速效磷、速效鉀、硝態氮和全氮含量呈顯著正相關關系(P ＜ 0.05)。第2 茬時，紫花苜蓿氮素積累量與土壤速效鉀、硝態氮、全氮含量呈顯著正相關關系，與土壤pH 呈顯著負相關關系，說明土壤pH 升高會抑制紫花苜蓿對氮素的積累(P ＜ 0.05)。第3 茬時，紫花苜蓿氮素積累量僅與土壤硝態氮和全氮含量呈顯著正相關關系(P ＜ 0.05)。說明隨著刈割茬次的增加，紫花苜蓿對氮素的積累由依賴氮、磷、鉀多營養元素的供應逐步轉變為對土壤氮含量的依賴，尤其是土壤硝態氮和全氮含量。

圖 5 不同茬次紫花苜蓿氮素積累量與土壤因子的關系Figure 5 Correlations between the nitrogen accumulation of alfalfa and soil chemical properties in different stubbles

3 討論

3.1 不同形態氮素對不同茬次紫花苜蓿根際土壤化學性質的影響

施肥能顯著改變土壤理化性質，土壤有機質、速效磷和速效鉀含量能夠表征土壤的養分水平，土壤全氮、硝態氮和銨態氮含量則反映了土壤的供氮能力[3,14,24]。Zia 等[25]在蘇格蘭斯凱島進行的模擬不同形態氮沉降的試驗中發現，添加不同比例的銨態氮和硝態氮對土壤可溶解有機碳沒有顯著影響，在∶ NO3-為9 ∶ 1 時添加生石灰能夠顯著增加土壤pH 和可溶解有機碳含量。與該研究結果相似，本研究中添加不同形態氮素并沒有顯著改變土壤有機質含量，其中銨態氮處理下的土壤有機質含量在數值上高于其他處理。在刈割第1 茬時，土壤速效磷含量在各處理組顯著高于對照組，隨著刈割茬次的增加，第2、3 茬土壤速效磷含量低于第1 茬，僅銨態氮處理高于其他處理組。這一方面是由于最初施基肥產生的正向效應，另一方面也說明土壤硝態氮可能促進植物對磷的吸收，從而使土壤速效磷的消耗增加，含量下降[11]。與土壤有機質、速效磷含量變化相比，土壤速效鉀含量受處理影響較大，各施氮處理下的土壤速效鉀含量顯著高于對照組，且在混合態氮處理組達到最高。但是，李燕青等[26]的研究發現，單施尿素沒有顯著改變土壤速效鉀含量，而單施豬糞、雞糞和牛糞則顯著增加了土壤速效鉀的含量。由于土壤中鉀的富集帶來的負面影響較小，并能促進植物吸收利用氮素，因此本研究中混合態氮處理下土壤速效鉀含量增加，也在一定程度上促進了紫花苜蓿對氮素的吸收和利用。土壤pH 只在第3 茬時發生了顯著變化，并且在各處理下都保持在中性偏堿的水平，說明外源氮素對土壤酸堿度的影響需要一段時間才能顯現出來。且添加銨態氮會促進H+的釋放而顯著降低土壤pH，添加硝態氮會因為大量釋放OH-而提高土壤pH[27]。以往研究表明土壤保持無機氮的能力與土壤pH、氮素形態、環境條件密切相關。當土壤pH 呈中性或堿性時，硝化作用強，土壤中無機氮以NO3-為主，而銨態氮常由于發生氨揮發而損失[28]。本研究中采用人工降水，保持水分適中，且土壤為中性偏堿性，因此土壤中NO3-相對穩定，硝態氮成為土壤氮素的主導形態。添加不同形態氮素處理對土壤銨態氮含量影響不顯著，這與王丹等[3]、王西娜等[29]的研究結果一致。除了添加的硝態氮源外，銨態氮的陽離子狀態使得它容易被帶負電荷的土壤膠體吸附固持，且易被硝化微生物轉化為硝態氮[3,30]，因此土壤硝態氮含量顯著提高。同時土壤全氮含量的增加也能提高礦化勢，增加氮的礦化量，提高植物對氮素的吸收和利用效率。

3.2 不同形態氮素對不同茬次紫花苜蓿氮素積累及利用的影響

不同植物對不同形態氮素的響應不同。越來越多的證據表明，植物對氮素資源的適應具有可塑性[21]，為了適應有效氮供應水平的波動，不同的植物群落可能會將它們對有機氮的依賴轉變為對銨態氮和硝態氮的依賴，這有助于它們適應自然界中氮素形態的變化[31-32]。本研究中添加不同形態氮素均能提高紫花苜蓿植株全氮、硝態氮及銨態氮含量，單施硝態氮和混合態氮處理組對提高植物氮含量和地上生物量的效果相似且具有明顯優勢，這也說明紫花苜蓿可能是一種“喜硝”植物[2]。如果外源施入的氮素形態與植物偏好的氮素形態相契合，植物就能更好地吸收和利用氮素[28]。在本研究中，土壤中的氮素形態以硝態氮為主導，而紫花苜蓿又偏好于硝態氮，因此在硝態氮處理下紫花苜蓿地上生物量更高。而由于較強的硝化作用將銨態氮轉化為硝態氮，因此混合施氮處理的效果要比單施硝、銨態氮肥效果好。于鐵峰等[33]的研究也發現，當∶為5 ∶ 3 時，紫花苜蓿的粗蛋白含量、蛋白總量、可消化干物質都顯著提高，綜合營養品質最佳。本研究中，無論是地上生物量、氮素積累量、氮素吸收效率和氮肥利用率，都在第2 茬時達到高峰，且施混合態氮處理表現最佳，這與葉芳等[12]的研究結果一致。劉曉靜等[4]的研究還發現在刈割第2 茬時，紫花苜蓿中的硝酸還原酶活性高于其他茬次，這在紫花苜蓿對氮肥的吸收利用中起到關鍵作用。此外，對于豆科植物，氮素形態也影響其生物固氮過程。以往研究結果發現在紫花苜蓿營養生長的旺盛階段，施氮會抑制其根瘤的固氮作用，且硝態氮對根瘤固氮的抑制作用要高于銨態氮。但是在紫花苜蓿苗期有效根瘤不多或者刈割后光合作用較弱時，其根瘤固氮不能滿足植物生長需求，依然需要補充相應氮素[8,34]。本研究在過程中監測了各處理下的結瘤率，發現在苗期有效根瘤不多，因此植株對氮的需求主要靠外源氮素補充。

本研究還發現氮素積累量在第1 茬時與土壤速效磷、速效鉀、全氮和硝態氮含量呈顯著正相關關系，在第2 茬時與土壤速效鉀、全氮和硝態氮含量呈顯著正相關關系，與土壤pH 呈顯著負相關關系，到了第3 茬時，僅與土壤硝態氮和全氮含量呈顯著正相關關系。說明隨著刈割茬次的增加，紫花苜蓿對氮素的積累由對土壤氮、磷、鉀養分的依賴轉為對土壤氮素形態的依賴，即隨著刈割茬次的增加，要適當為紫花苜蓿補充氮素，尤其是硝態氮的供應才能保證它對氮素的積累。由于在紫花苜蓿生產中是否需要施氮肥一直存在爭議，持反對觀點的認為施氮會抑制根瘤形成、增加土壤酸性、促進雜草生長、降低苜蓿的競爭力[7]。本研究的結果認為適量適時施氮，尤其是選擇恰當的外源氮素形態是有利于紫花苜蓿的生長和持續利用的。此外，今后進一步研究氮素轉化過程中不同酶的活性、功能微生物的作用，通過微生物途徑增強氮素有效性，提高植物對氮素的吸收、利用和積累，能夠降低化學氮肥的負面作用。

4 結論

本研究結果表明在pH 7.3～8.6 的中性偏堿性土壤中，不同形態氮素對紫花苜蓿生長及氮素積累和利用的影響各有差異，單施硝態氮和混合態氮更有利于紫花苜蓿的產量和對氮素的吸收、利用和積累。生長第1 年的苜蓿在不同茬次對土壤養分變化的響應不同，刈割第2 茬是紫花苜蓿生長和對氮素利用的最佳時期，隨著刈割茬次的增加，紫花苜蓿對氮素的依賴增強，建議在刈割第2 茬后補充硝態氮或混合態氮以保障其產量和植株氮含量，從而提升飼用品質。