解毒活血方治療冠心病的網絡藥理學機制研究

劉素麗， 吳輝， 黃龐寧， 陳秋岑

（廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州 510405）

冠心病（coronary heart disease，CHD）已成為當前嚴重威脅人類健康最常見的心血管疾病之一。根據《中國心血管病報告2018》[1]數據顯示，我國冠心病患者已逾1 100萬，加強冠心病的中醫藥防治研究意義重大。冠心病屬中醫學“胸痹”“心痛”等病證范疇，其病位在心，涉及肝脾腎等臟，屬本虛標實之證，本虛有氣虛、陽虛、陰虛，標實有痰濁、血瘀、氣滯、寒凝等[2]。“瘀毒”“毒瘀”病機理論是闡釋冠心病發生發展的重要學說[3]。解毒活血方是廣州中醫藥大學第一附屬醫院心血管科經驗方，由黃芩、黃連、丹參、赤芍、川芎等中藥組成，具有清熱解毒、活血袪瘀功效。現代藥理學研究表明，黃芩具有抗動脈粥樣硬化、治療冠心病的作用[4]；黃連具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗血小板聚集等作用[5]；丹參具有抑制血小板聚集、擴張血管、抗動脈粥樣硬化、改善微循環等作用[6]；赤芍具有抗炎、抗凝、抗血栓等作用[7]；川芎具有減輕血管內皮損傷等作用[8]。可見，解毒活血方可從多重角度、多重作用途徑治療冠心病，但具體作用機制仍不明確。

網絡藥理學是通過數據挖掘及分析，探索中藥方劑有效成分與疾病的關系、展現藥物與疾病間作用機制的科學方法。因此，本研究運用網絡藥理學探討解毒活血方治療冠心病的作用機制，以期為該方的臨床應用及進一步的藥理作用機制研究提供理論依據和研究思路，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 解毒活血方活性成分及相應靶標的篩選 借助中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），依次輸入關鍵詞“黃芩”“黃連”“丹參”“赤芍”“川芎”，檢索收集解毒活血方的活性成分，以生物利用度（OB）＞30%且類藥性（DL）＞0.18 為條件，篩選出利用度及活性偏高的有效活性成分；并從該數據庫篩選出解毒活血方中所有中藥對應的靶標，與已篩選出的活性成分進行對比，篩選出該活性成分對應的靶標。應用通用蛋白質數據庫（UniProt）（http：// www.uniprot.org/uploadlists/），將獲得的藥物活性成分靶標進行通用名稱注釋。

1.2 冠心病靶標的收集及解毒活血方活性成分與冠心病共同作用靶標的獲取 借助GeneCards 數據庫（https：//www.genecards.org/）及在線人類孟德爾遺傳（OMIM）數據庫（https：//omim.org/），依次輸入關鍵詞“coronary heart disease”“CHD”，檢索獲得冠心病相關靶標，應用Venny 2.1 軟件（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制解毒活血方活性成分靶標與冠心病相關靶標關系的韋恩圖。此交集中的靶標，即活性成分與冠心病共同作用的靶標。

1.3 構建解毒活血方治療冠心病活性成分-共同作用靶標網絡及共同作用靶標互作網絡 借助Cytoscape 3.7.2 軟件構建解毒活血方治療冠心病活性成分-共同作用靶標網絡，將其互作關系進行可視化。將共同作用靶標借助STRING數據庫在線檢索（物種設為“Homo sapiens”），繪制成靶標蛋白互作網絡，獲取蛋白互作信息，操作過程中將“minimum required interaction score”設為“highest confidence（0.900）”，并將“display simplifications”設為“hide disconnected nodes in the network”，其余參數保持默認設置。利用R 語言軟件，根據靶標鄰接節點的多少進行排序，獲取核心作用靶點，選取數量排名前30 位的靶標，并以柱狀圖形式展現。

1.4 靶標的功能富集分析及相關通路的富集分析 借助R 語言利用Bioconductor 軟件（http：//www.bioconductor.org/install/），將解毒活血方活性成分與冠心病共同作用的靶行基因本體論（GO）生物功能富集分析，以及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，并可視化。

2 結果

2.1 解毒活血方活性成分及相關靶點的篩選 借助TCMSP 數據庫，以OB＞30%且DL＞0.18 為條件，篩選出解毒活血方中143 個活性成分，按OB大小降序排列，選取前20 個活性成分（見表1）列舉，并篩選出以上143 個活性成分對應的相關靶標，且在UniProt 數據庫中找到其相應靶標進行通用名注釋（若未找到相應靶標，則刪除），共220 個。

2.2 冠心病相關靶標收集及解毒活血方活性成分與冠心病共同作用靶標的獲取 借助GeneCards、OMIM 數據庫篩選冠心病相關靶點，共10 717 個，應用Venny 2.1 軟件，繪制解毒活血方活性成分靶標與冠心病相關靶標關系的韋恩圖（見圖1），獲得204個共同作用靶標。

2.3 構建解毒活血方治療冠心病活性成分-共同作用靶標網絡及共同作用靶標互作網絡 借助Cytoscape 3.7.2 軟件將143 個活性成分與204 個共同作用靶標的互作關系以網絡圖形式進行可視化（見圖2），其中外圈三角形節點代表共同作用靶標，內圈正方形節點代表活性成分，中間菱形節點代表解毒活血方，圓形節點代表冠心病，邊（節點之間的連線）代表節點之間的互作關系。從圖2可見，一個活性成分可作用多個靶標，多個活性成分可作用一個靶標。

圖1 解毒活血方活性成分靶標與冠心病相關靶標的韋恩圖Figure 1 Venn diagram of the targets of the active ingredients of Removing Toxins to Activate Blood Recipe and the targets of coronary heart disease

圖2 解毒活血方治療冠心病活性成分-共同靶標互作網絡Figure 2 Active ingredient-common target interaction network of Removing Toxins to Activate Blood Recipe

按照鏈接靶標數量降序排列，解毒活血方治療冠心病前5位的活性成分主要有槲皮素、木犀草素、漢黃芩素、丹參酮iia、黃芩素等；按照鏈接活性成分數量降序排列，解毒活血方治療冠心病前5 位的主要靶標有PTGS2、PTGS1、SCN5A、NCOA2、ADRB2。將共同作用靶標，借助STRING數據庫，繪制靶標互作網絡（見圖3），共顯示177 個靶標（數據庫中未找到及離散的靶標均不顯示），節點代表靶標，邊代表靶標互作關系。

利用R 語言軟件，根據靶標鄰接節點的多少進行排序，獲取核心靶標，選取數量排名前30 位的靶標，包括STAT3、JUN、AKT1、MAPK1、APP等，以柱狀圖（見圖4）形式展現。

2.4 GO功能富集分析及KEGG通路的富集分析 借助R語言利用Bioconductor軟件對共同靶點進行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，運行過程中以P＜0.05 為篩選條件。得到GO 分析結果184 個，選取前20位以氣泡圖（見圖5）形式進行可視化。可見解毒活血方治療冠心病的生物過程主要參與細胞因子受體結合、細胞因子活性、四吡咯結合、血紅素結合、核受體的活性、G 蛋白偶聯受體活性、氧化還原酶活性、抗氧化活性、類固醇激素受體活性、類固醇結合、腎上腺素能受體活性、兒茶酚胺結合等方面。

得到KEGG分析結果165個，選取前20位以氣泡圖（見圖6）形式進行可視化。可見解毒活血方治療冠心病的KEGG 通路有磷脂酰肌醇-3-羥激酶（PI3K）-蘇氨酸激酶（Akt）信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、高級糖化終產物及其受體（AGE-RAGE）信號通路、白細胞介素17（IL-17）信號通路、低氧誘導因子1（HIF-1）信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路等。

圖3 共同作用靶標蛋白互作網絡Figure 3 PPI network of the common targets

圖4 鄰接節點數排名前30位的核心靶標Figure 4 The top 30 targets based on the number of adjacent nodes

圖5 解毒活血方對冠心病作用的前20位GO功能富集分析結果Figure 5 The top 20 of GO biological process enrichment analysis results for effects of Removing Toxins to Activate Blood Recipe on coronary heart disease

圖6 解毒活血方對冠心病作用的前20位KEGG通路富集分析結果Figure 6 The top 20 of KEGG pathway enrichment analysis results for effects of Removing Toxins to Activate Blood Recipe on coronary heart disease

3 討論

冠心病的主要病理基礎是動脈粥樣硬化，在目前有關動脈粥樣硬化發病機制的學說中，炎癥反應學說已得到公認[9]，炎癥反應參與了動脈粥樣硬化的發生、發展及斑塊破裂、血栓形成等整個病理進程[10-12]。結合該炎癥機制學說，本課題組針對動脈粥樣硬化及冠心病提出了中醫“毒瘀”病機學說。該學說認為，動脈粥樣硬化發病機制中的各種致病因素如氧化低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）、毒性氧自由基、凝血/纖溶產物和炎性細胞因子等，相當于中醫之“毒邪”，其損傷血管內皮并進入內膜而啟動血管壁內的炎癥反應，相當于“毒邪入侵”，“毒邪”稽留不去蘊久化熱，可致毒結致瘀等病理改變，這些與炎癥激活、斑塊形成、斑塊潰爛/出血、血栓形成等一系列病理改變相關聯，此即“毒損脈絡”之過程。在該病機學說指導下，本課題組以解毒活血方為基礎，針對解毒活血法治療冠心病的臨床療效及機制進行了許多有益探索：臨床研究表明，運用解毒活血方治療非ST 段抬高急性冠狀動脈綜合征（NSTEACS），可顯著改善該類患者臨床癥狀，下調血清CD40、核因子kappaB（NF-κB）的表達，提示解毒活血方治療冠心病可能與其抗炎機制相關[13]；早期基礎研究顯示，解毒活血方可預防兔動脈粥樣硬化易損斑塊的形成，降低易損斑塊內及血清TNF-α、細胞間黏附分子1（ICAM-1）表達，抑制易損斑塊底部和肩部的炎癥，調節血脂，從而穩定斑塊[14-15]。基于此，進一步探索解毒活血方抗冠狀動脈粥樣硬化及穩定斑塊的機制。

本研究結果顯示，解毒活血方防治冠心病是多成分、多靶點、多機制的綜合過程。根據GO及KEGG 富集分析結果，其生物過程與細胞因子受體結合、細胞因子活性、四吡咯結合、血紅素結合、核受體的活性、氧化還原酶活性、抗氧化活性、類固醇激素受體活性、類固醇結合、G蛋白偶聯受體活性、腎上腺素能受體活性、兒茶酚胺結合等密切相關，解毒活血方干預冠心病涉及的信號通路主要包括PI3K-Akt 信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路等。結合文獻發現：細胞因子有介導炎癥、增加血小板數目及活性等作用，促進冠狀動脈粥樣硬化形成、增加粥樣斑塊的不穩定性、促進冠狀動脈內血栓形成和痙攣等，與冠心病密切相關[16]；膽紅素是一種具有天然抗氧化的四吡咯色素，血紅蛋白的降解為其形成的主要途徑，通過防止LDL-C的氧化修飾而防止動脈粥樣硬化的形成[17]；核受體及其配體可參與調節血糖、血脂[18]，而血糖、血脂代謝異常是冠心病的獨立危險因素；PI3K-Akt 通路與炎癥介導、心肌細胞凋亡、血管內皮再生等有關，與冠心病關系密切相關[19]；流體剪切應力與動脈粥樣硬化斑塊的形成密切相關[20]；HIF-1能夠引起內皮細胞功能障礙、增殖、血管生成和炎癥，通過多種途徑在動脈粥樣硬化的發病機理中發揮作用[21]；AGE-RAGE 的激活可以誘導復雜的信號傳導，從而導致炎癥增加、氧化應激、鈣沉積增加和血管平滑肌細胞凋亡增加，導致動脈粥樣硬化的發展，AGE-RAGE 可能是通過這些機制成為冠心病發展的重要媒介[22]。

綜上所述，我們認為解毒活血方治療冠心病主要與其參與調控的炎癥介質、動脈粥樣硬化形成、血栓形成、血管內皮損傷、血管平滑肌收縮、調節心率等有關，尤其與參與調控細胞因子及PI3K-Akt 通路相關的炎癥介導、動脈粥樣硬化形成、血栓形成、血管內皮損傷等密切相關。而解毒活血方的應用進一步證實了“毒瘀互結”與冠心病的密切相關性，并證明了解毒活血法是用于治療冠心病重要法則之一。另外值得關注的是，解毒活血方干預冠心病涉及的AGE-RAGE 信號通路在冠心病的病理生理機制中扮演著重要的角色，作為重要的心臟代謝危險因素[23]，因此我們提出在下一步應用解毒活血方對冠心病的防治研究中，對AGE-RAGE信號通路的研究應有所側重。