補腎益精健脾養血方對貧血大鼠骨髓細胞凋亡的影響

王正引， 陳燕， 劉蔚雯， 郭明章， 張小如

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建福州 350122；2.福建中醫藥大學中醫學院，福建福州 350122）

貧血是臨床上常見的一種因外周血紅細胞容量減少，血液攜氧能力下降而導致循環、神經、消化等多系統癥狀的綜合征，以血紅蛋白濃度低于正常范圍下限為臨床診斷依據。貧血可原發于造血系統或是繼發于系統性疾病，原發性病因如骨髓造血功能衰竭、造血細胞凋亡亢進、造血原料不足或利用障礙等，繼發性病因如腎功能不全、感染、腫瘤等[1-2]。中醫學對貧血的辨證論治，認為其證屬血虛。而血虛的成因，既有先天稟賦不足，又有后天調攝失當。腎中所藏先天之精可化髓為血。《景岳全書·血證》曰：“血即精之屬也，但精藏于腎，所蘊不多，而血富于沖，所至皆是。”脾為后天之本，氣血生化之源?！蹲x醫隨筆》曰：“夫血者，水谷之精微，得命門真火蒸化?！笨梢娖⒌倪\化是精血化生的基礎，而腎中精氣可化生元氣，促進脾胃運化水谷精微，化為營血。故腎精虧虛、脾失健運是造成血虛的主要原因之一。補腎益精健脾養血方源自于本校張小如教授研發的康欣口服液（國藥準字B20020032），全方由制首烏、黃芪、枸杞子、黃精、女貞子、當歸組成，該方以補腎健脾為主，益精髓補中氣以資化源，達到養血補血的目的。為從分子水平進一步探討該方抗貧血的作用機制，本研究通過觀察補腎益精健脾養血方對貧血大鼠骨髓細胞凋亡及凋亡調控分子B-細胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因（Bcl-2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bax），凋亡執行分子半胱天冬氨酸蛋白酶（Caspase）3、Caspase 8 表達的影響，以期為臨床應用補腎益精健脾養血方治療貧血提供依據?，F將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 48 只清潔級6 月齡Wistar 大鼠，雌雄各半，體質量（200±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物質量合格證號：SCXK（滬）2012-0002。大鼠常規飼養于福建省中醫藥研究院動物實驗室，溫度（21±1）℃，相對濕度55%±5%。

1.2 實驗藥物 補腎益精健脾養血方組成：制首烏12 g、黃芪12 g、枸杞子10 g、黃精10 g、女貞子10 g、當歸10 g。中藥飲片購自福州中正醫藥連鎖有限公司。將飲片用水浸泡30 min，煎煮2 次，取2 次水煎液合并后過濾、濃縮至每mL 藥液含生藥量2.4 g，置于4 ℃冰箱中保存備用。成人日給藥總量合計為64 g，根據等效劑量折算系數[3]計算大鼠日給藥劑量為6 g·kg-1·d-1，按1∶2∶4 比例計算低、中、高劑量給藥分別為6、12、24 g·kg-1·d-1。

1.3 主要試劑與儀器 注射用環磷酰胺（德國Baxter Oncology GmbH 公司，批號：6K148A）；肌苷片（北京中新藥業股份有限公司，批號：161103）；Bax、Bcl-2、Caspase 3、Caspase 8 抗體（英國Abcam公司）；總蛋白提取試劑盒（上海純優生物科技有限公司）；電化學發光（ECL）試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）細胞凋亡原位檢測試劑盒（瑞士Roche公司）；聚偏氟乙烯（PVDF）膜（美國Millipore 公司）。XT2000iv 全自動血液分析儀（日本Sysmex 公司）；Centrifuge 5415D低溫離心機（德國Eppendorf公司）；GDS-8000凝膠成像系統（美國UVP公司）。

1.4 動物分組、造模與給藥 將48只Wistar大鼠隨機分為6 組，分別為空白組，模型組，中藥低、中、高劑量組，肌苷組（陽性對照），每組8只。大鼠適應性飼養1 周后，參照化學損傷法[4]復制貧血模型。方法：模型組、各給藥組于實驗第1天給予大鼠腹腔注射環磷酰胺，隔日1次，共4次，劑量分別為0.06、0.06、0.03、0.03 g·kg-1·d-1；空白組給予等容積生理鹽水腹腔注射。造模同期，即于實驗第1天開始中藥低、中、高劑量組給予大鼠補腎益精健脾養血方6、12、24 g·kg-1·d-1灌胃，肌苷組給予肌苷0.05 g·kg-1·d-1灌胃，空白組和模型組則給予等容積的生理鹽水灌胃，每日1 次，給藥2 周。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 外周血象檢測 給藥結束后，即于實驗第15 天，從大鼠眼眶后靜脈叢采血，用全自動血液分析儀檢測外周血紅細胞數、白細胞數、血小板數及血紅蛋白含量。通過各組外周血象比較，判斷模型是否建立成功[5-6]以及方藥是否有抗貧血的作用。

1.5.2 骨髓細胞采集 采血后，頸椎脫臼處死大鼠，以38 g·L-1枸櫞酸鈉及磷酸鹽緩沖液（PBS）按1∶9 配制骨髓沖液。取大鼠股骨，暴露兩端骨髓，用帶有5 號針頭的1 mL 注射器吸取骨髓沖液反復沖洗得骨髓懸液。用PBS 沖洗2 ～3 次，然后以12 000 r/min 離心15 min 收集細胞，于-80 ℃保存，以備用于蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測。

1.5.3 骨髓細胞凋亡檢測 取制備的骨髓懸液制作細胞涂片，以40 g·L-1多聚甲醛固定30 min，應用TUNEL試劑盒進行染色。每張TUNEL切片在光鏡下連續觀察5個陽性細胞最多的高倍視野，以每個視野100個細胞計數。細胞核呈現出棕黃色或者棕褐色染色的細胞為陽性細胞，細胞核藍染的細胞是蘇木素復染的陰性細胞。計算陽性細胞數與總細胞數的百分比，即凋亡百分率。

1.5.4 Western Blot 法檢測骨髓細胞Bax、Bcl-2、Caspase 3、Caspase 8 蛋白表達 取骨髓細胞樣本，用總蛋白提取試劑盒提取蛋白?？偟鞍咨蠘与娪竞?，在電轉液中65 V電壓，2 h轉膜，將蛋白從分離膠轉至PVDF膜，置于封閉液中，室溫封閉1 h。將Bax、Bcl-2、Caspase 3、Caspase 8 等一抗按1∶1 000 稀釋，將封閉后的膜放入一抗工作液中，于4 ℃反應過夜。洗膜3 次，每次10 min。再將二抗按1∶3 000稀釋，將洗滌后的一抗反應膜放入二抗工作液中，室溫孵育1 h。洗膜3 次，每次10 min。按電化學發光法曝光、洗片，應用凝膠成像分析儀對膠片進行掃描，檢測條帶灰度值，進行Bax、Bcl-2、Caspase 3、Caspase 8 半 定 量 分析。計算目的蛋白條帶灰度值與內參β-actin 條帶灰度值的比值，表示目的蛋白的相對表達含量。

1.6 統計方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，計量數據以均數±標準差（±s）表示。對于正態分布且方差齊同的數據采用單因素方差分析和最小顯著差異LSD-t檢驗。非正態分布或方差不齊的數據采用Nemenyi 法[7]進行非參數檢驗。以P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠外周血象比較 表1 結果顯示：與空白組比較，模型組紅細胞數、白細胞數、血小板數及血紅蛋白含量均顯著降低（P ＜0.05），表明貧血模型建立。與模型組比較，中藥低劑量組和肌苷組紅細胞數、白細胞數、血小板數及血紅蛋白含量均明顯升高（P ＜0.05）。中藥中劑量組和高劑量組紅細胞數、白細胞數、血小板數及血紅蛋白含量均升高，其中白細胞數及血小板數顯著升高，差異有統計學意義（P ＜0.05）。表明補腎益精健脾養血方具有抗貧血作用。

表1 各組大鼠外周血象比較Table 1 Comparison of the peripheral hemogram in rats of various groups （±s）

表1 各組大鼠外周血象比較Table 1 Comparison of the peripheral hemogram in rats of various groups （±s）

①P ＜0.05，與空白組比較；②P ＜0.05，與模型組比較

組別空白組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組肌苷組鼠數（只）8 8 8 8 8 8紅細胞數（1012·L-1）7.71±0.58 2.63±1.59①5.98±0.32②5.00±0.33 5.56±0.27 6.04±0.17②白細胞數（109·L-1）9.01±1.34 3.75±1.81①6.52±1.49②8.37±1.61②9.72±1.31②12.96±1.31②血小板數（109·L-1）934.88±72.21 669.75±246.77①955.38±245.14②1 219.63±178.08②1 078.38±129.48②956.38±252.66②血紅蛋白含量（g·L-1）146.88±8.15 60.88±30.55①122.63±3.85②104.75±6.88 109.38±5.24 119.25±6.18②

2.2 各組大鼠骨髓細胞凋亡情況比較 圖1 結果顯示：與空白組比較，模型組陽性細胞即凋亡細胞明顯增多，細胞固縮，細胞核致密深染呈棕黃色或棕褐色，蘇木素復染后，細胞核呈藍色的陰性細胞即正常骨髓細胞明顯減少。與模型組比較，中藥各劑量組及肌苷組凋亡細胞減少，正常骨髓細胞增多。

圖1 各組大鼠骨髓細胞凋亡病理特征比較（TUNEL法，×400）Figure 1 Comparison of the pathological features of marrow cells apoptosis in rats of various groups（by TUNEL，×400）

表2結果顯示：與空白組比較，模型組骨髓細胞凋亡百分率顯著升高（P ＜0.05）；與模型組比較，中藥各劑量組及肌苷組骨髓細胞凋亡百分率均降低，其中，中藥中、高劑量組和肌苷組差異有統計學意義（P ＜0.05）。

2.3 各組大鼠骨髓細胞Bax、Bcl-2、Caspase 3、Caspase 8 蛋白表達水平比較 圖2、表3 結果顯示：與空白組比較，模型組骨髓細胞Bax、Caspase 3、Caspase 8 相對蛋白含量顯著升高，Bcl-2相對蛋白含量顯著降低，差異均有統計學意義（P ＜0.05）。與模型組比較，中藥各劑量組及肌苷組Bax、Caspase 3 及Caspase 8 相對蛋白含量顯著降低，Bcl-2相對蛋白含量顯著升高，差異均有統計學意義（P ＜0.05）。

表2 各組大鼠骨髓細胞凋亡百分率比較Table 2 Comparison of the percents of marrow cells apoptosis in rats of various groups （±s）

表2 各組大鼠骨髓細胞凋亡百分率比較Table 2 Comparison of the percents of marrow cells apoptosis in rats of various groups （±s）

①P ＜0.05，與空白組比較；②P ＜0.05，與模型組比較

組別空白組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組肌苷組鼠數（只）8 8 8 8 8 8骨髓細胞凋亡百分率（%）2.00±0.76 66.36±5.37①35.13±4.32 21.63±3.58②19.13±10.33②16.38±1.92②

圖2 各組大鼠骨髓細胞Bax、Bcl-2、Caspase 3、Caspase 8 的Western Blot電泳條帶Figure 2 Western blotting strips of Bax，Bcl-2，Caspase 3 and Caspase 8 in marrow cells from rats of various groups

表3 各組大鼠骨髓細胞Bax、Bcl-2、Caspase 3、Caspase 8蛋白表達水平比較Table 3 Comparison of the protein expression levels of Bax，Bcl-2，Caspase 3 and Caspase 8 in rat marrow cells of various groups （±s）

表3 各組大鼠骨髓細胞Bax、Bcl-2、Caspase 3、Caspase 8蛋白表達水平比較Table 3 Comparison of the protein expression levels of Bax，Bcl-2，Caspase 3 and Caspase 8 in rat marrow cells of various groups （±s）

①P ＜0.05，與空白組比較；②P ＜0.05，與模型組比較

images/BZ_142_1264_2617_1266_2617.png組別空白組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組肌苷組鼠數（只）8 8 8 8 8 8 Bax相對表達量0.27±0.11 1.12±0.16①0.86±0.22②0.81±0.20②0.75±0.22②0.62±0.22②Bcl-2相對表達量1.41±0.19 0.45±0.15①0.70±0.19②0.84±0.22②0.94±0.22②1.01±0.25②Caspase 3相對表達量0.24±0.04 1.14±0.21①0.87±0.14②0.83±0.11②0.69±0.12②0.48±0.14②Caspase 8相對表達量0.46±0.14 1.35±0.27①0.99±0.18②0.89±0.28②0.78±0.21②0.65±0.17②

3 討論

骨髓造血功能下降是造成貧血的重要發病機制。骨髓單個核細胞是廣義的造血細胞，有研究表明，造血干細胞數量減少與骨髓細胞凋亡增加有關[8]。再生障礙性貧血患者骨髓單個核細胞凋亡增加，通過阻止細胞周期和死亡相關因子（Fas）信號通路促進CD34+細胞的凋亡，并能抑制凋亡抑制基因B-細胞淋巴瘤/白血病-長x蛋白（Bcl-xL）在紅細胞譜系的表達[9-10]。由于凋亡基因的啟動激活，或基質細胞造血存活因子獲得性缺陷，或毒物的直接作用及介導免疫反應對骨髓造成損傷[11]，從而破壞骨髓造血微環境，導致貧血。

Bcl-2家族在細胞凋亡信號傳導的線粒體通路中起調節作用，Bax是Bcl-2家族中一個重要的促凋亡因子，可通過改變線粒體膜的滲透性，使細胞色素C由線粒體釋放到胞漿，進一步激活下游的Caspase，導致細胞凋亡。Bcl-2 可與Bax 形成異構二聚體，阻止細胞色素c、第二線粒體來源胱氨酸酶激活劑（Smac）釋放，進而抑制細胞凋亡[12-13]。Caspase 3 與Caspase 8 既是細胞凋亡信號傳導的共同通路，又是導致細胞凋亡關鍵的啟動和執行分子。Caspase 3 激活后，可催化裂解二磷酸腺苷核糖多聚酶，抑制DNA 修復，并促使核酸內切酶的活化，裂解細胞關鍵結構蛋白，破壞細胞的正常形態。Caspase 8 激活后，可進一步誘導線粒體釋放細胞色素C，放大凋亡信號，加速細胞凋亡[14-15]。

中醫學認為腎藏精，腎主骨生髓，腎中精氣可化生元氣，促進脾胃運化水谷精微，而血的生成源于脾所運化產生的水谷精微以及腎所藏之精髓。因此，從補腎健脾的角度進行抗貧血機制研究，符合中醫辨證論治的特點。補腎益精健脾養血方以制首烏、黃芪為君藥，制首烏性味甘溫，歸肝、腎經，功可補益精血，益腎固精，常用于血虛所致的頭暈目眩、心悸失眠、面色萎黃、體倦乏力等癥，黃芪甘而微溫，歸脾、肺經，可健脾益氣而生血，用于氣虛血虧。枸杞子、黃精為臣藥，枸杞子甘平，歸肝、腎經，可補肝腎，益精血，黃精味甘性平，歸脾、肺、腎經，可滋腎填精，健脾益氣，以補養陰血。女貞子、當歸為佐藥，女貞子味甘苦性涼，入肝、腎經，可補肝腎之陰，益精養血，當歸甘辛而溫，歸肝、心、脾經，既補血，又活血，《景岳全書》謂其為“血中之氣藥”，使補血而不滯血。諸藥相合，補腎益精健脾益氣，從而養血補血。

本研究結果表明，補腎益精健脾養血方可升高貧血大鼠外周血紅細胞數、白細胞數、血小板數及血紅蛋白含量，改善貧血大鼠的外周血象，降低貧血大鼠骨髓細胞凋亡百分率，下調促凋亡分子Bax、Caspase 3 與Caspase 8 蛋白表達，上調抗凋亡分子Bcl-2 蛋白表達。提示本方抗貧血作用機制可能是通過減少骨髓細胞凋亡，從而改善骨髓造血微環境，以治療貧血。

本研究基于中醫脾腎的藏象理論，從骨髓細胞凋亡的角度，探討補腎益精健脾養血方補血作用機制，進一步夯實補血方藥多元化研究基礎。但初步的實驗結果尚存在一些不足之處。經補腎益精健脾養血方各劑量組結果比較，對于紅細胞數、血紅蛋白含量的影響，低劑量組優于中、高劑量組；對于白細胞數、血小板數、骨髓細胞凋亡百分率、Bax、Bcl-2、Caspase 3 與Caspase 8 蛋白表達的影響，中、高劑量組優于低劑量組，組間比較雖有一定差異，但無統計學意義。表明各劑量組未能體現明顯的量效相關性，因此在今后的研究中應設計更為合理的給藥劑量。而鑒于細胞凋亡信號傳導受多靶點調節，在下一階段工作中，將圍繞補腎益精健脾養血方對細胞色素c、Smac、Bcl-xL、Fas 等其他關鍵調控因子的影響進行研究。