雙氫青蒿素對Ⅱ型膠原誘導的類風濕關節炎大鼠的抗炎和軟骨修復作用

張俊， 袁映紅， 馮志蔚， 肖濤， 孔亮， 蔣科

（1.南充市中心醫院嘉陵分院骨科，四川南充 637500；2.川北醫學院附屬醫院骨科，四川南充 637000）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性全身性自身免疫性疾病，其主要表現為滑膜炎癥伴關節軟骨及骨質破壞等[1]。調節免疫異常、消除炎癥反應是治療RA的關鍵[2]。目前對RA的西藥治療主要包括非甾體抗炎藥/糖皮質激素等[3-4]，但這些藥物均有較大的副作用；單純中藥治療RA 毒副作用小，但效果并不非常顯著[5]。青蒿素是從菊科植物黃花蒿（Artemisiaannua L.全草）中提取的含有過氧基團的倍半萜內酯（藥用植物的生物活性組分）的藥物。青蒿素及其已上市衍生物是臨床常用的抗瘧藥物。現有研究還發現青蒿素及青蒿素衍生物對體液免疫和細胞免疫均有明顯的抑制作用，同時具有較好的抑制炎癥效果，且安全性高[6-7]，其作為抗炎免疫調節藥物越來越受到重視。雙氫青蒿素（dihydroartemisinin）是青蒿素的衍生物之一，是青蒿素經四氫硼鈉還原而成，分子式為C15H24O5，相對分子質量為284.35，是青蒿素類藥物在體內的主要的活性形式之一。已經有研究表明，雙氫青蒿素具有抗RA 作用[8]。本研究建立Ⅱ型膠原誘導RA動物模型模擬RA發病[8]，進一步探討雙氫青蒿素對RA大鼠抗炎反應和軟骨修復的影響，以期為RA 患者臨床治療提供參考依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級6周齡SD雄性大鼠75只，購自廣東醫學院實驗動物中心，粵監證字2018A029號，動物許可證號：SYXK2018-0056。于川北醫學院實驗動物中心SPF 級動物房中進行常規飼養，自由飲水、進食，溫度25 ℃，光照/黑暗各12 h。本實驗已經過動物倫理委員會批準同意且本動物實驗嚴格遵循動物實驗減少（reduction）、優化（refinement）和替代（replacement）-3R原則。

1.2 藥物與試劑 雙氫青蒿素（CAS 號：71939-50-9；商品號：EBD2184717）（上海源葉生物科技有限公司）。腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素10（IL-10）、白細胞介素17（IL-17）、白細胞介素23（IL-23）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海恒遠生物科技有限公司）；成骨細胞特異性轉 錄 因 子Osterix（Osx）、Ⅰ型 膠 原 蛋 白α1 鏈（COL1A1）和骨鈣素（OC）等抗體（上海艾博抗有限公司）；蘇木素、伊紅（武漢博士得生物有限公司）；中性福爾馬林、酒精、二甲苯（天津科密歐有限公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG等二抗（美國Thermo公司）。

1.3 儀器 YLS-7C足趾容積測量儀（江蘇賽昂斯生物科技有限公司）；BS-124s型電子天平（北京賽多斯儀器系統有限公司）；415D 離心機（德國Eppendorf公司）；Dexa Pro-I X 線骨密度儀（徐州品源電子科技有限公司）；LD-66切片機（長沙益廣制藥機械公司）；SG-51 正顯微鏡（上海光學儀器廠）；蛋白電泳及轉膜儀（美國Bio-Rad 公司）；凝膠成像系統（以色列DNR公司）。

1.4 分組與模型建立 將75 只大鼠適應性喂養1 周后，采用隨機分組法將大鼠分為假手術組，模型組，雙氫青蒿素低、中、高劑量組，每組各15 只。除假手術組外，其余各組大鼠均給予膠原誘導法構建RA模型，造模方法和判斷造模是否成功的標準參考Fujii 等[9-10]研究。具體操作方法：用乙酸溶液溶解Ⅱ型膠原制成膠原溶液2 g/L，將等體積的膠原溶液和不完全弗氏佐劑充分乳化混勻至滴1滴乳劑于蒸餾水水面凝而不散時，示乳化劑配制成功。取400 μg 膠原乳化劑注射大鼠右足跖部皮下致炎，并于造模第14 天同法給予100 μg膠原乳化劑加強免疫。于造模第20 天，應用相機拍照和X 射線拍攝觀察大鼠足跖部，以出現嚴重紅腫、連續低密度影及溶骨現象表明造模成功。

1.5 藥物干預 于初次免疫21 d，參考文獻[11]中的雙氫青蒿素給藥劑量進行干預，雙氫青蒿素低、中、高劑量組大鼠分別對應給予雙氫青蒿素6.25 、12.5、25 mg/kg（分別相當于成人用藥劑量39.06、78.13、156.25 mg）灌胃處理，假手術組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，每日1次，連續給藥2周。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 大鼠骨指標檢測 末次給藥后24 h脫頸處死大鼠，分離出脛骨，置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定，依次進行脫鈣、脫水處理，石蠟包埋、切片，應用雙能X 線骨密度儀測量大鼠骨體積分數（bone volume/total volume，BV/TV）、骨表面積/骨體積（bone surface/bone volume，BS/BV）、骨小梁厚度（trabecular bone thickness，Tb.Th）、骨小梁數量（trabecular bone number，Tb.N）值。

1.6.2 踝關節組織病理學觀察 按“1.6.1”項方法制備踝關節組織切片，采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察踝關節組織病理學表現，阿利新藍染色法觀察踝關節軟骨組織蛋白多糖的表達，采用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色法觀察踝關節骨組織破骨細胞情況[12]。

1.6.3 ELISA 法檢測外周血中炎癥因子TNF-α、IL-17、IL-23和IL-10的含量 處死大鼠后，前頸動脈采血0.5 mL，以1 200 r/min 4 ℃離心10 min，收集上清液。具體操作方法嚴格按照TNF-α、IL-17、IL-23、IL-10 等ELISA試劑盒說明書進行。

1.6.4 蛋白免疫印跡法檢測踝關節組織Osx、COL1A1、OC的表達 末次給藥后24 h脫頸處死大鼠，取踝關節置于液氮快速冷凍，制成踝關節勻漿，提取總蛋白并調節各組蛋白濃度相同，依次進行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離蛋白、轉移蛋白至PVDF膜、以50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h、Osx（1∶500）4 ℃孵育過夜、二抗孵育2 h、顯影曝光等步驟。最后應用ImageJ 軟件分析目標蛋白條帶灰度值。COL1A1、OC等指標的檢測方法同上。

1.6.5 實時定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測踝關節組織骨吸收功能相關基因OSCA、TRAP 的表達情況 取大鼠踝關節標本，切片機切碎后使用胰蛋白酶消化，使用TRIzol 試劑提取總RNA，測定RNA 濃度和純度后，用反轉錄試劑盒合成cDNA，用PCR儀進行擴增。PCR反應條件：95 ℃5 min，95 ℃10 s、65 ℃30 s、72 ℃1 min 進行40 個循環。具體步驟按照試劑盒方法操作。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，以GADPH 為內參。OSCAR上游引物序列為5’-TGTTGGCTGCC GCTCACTTTG-3’，下游引物序列為5’-GACGCT GCTCGCTCCATTCAC-3’；TRAP 上游引物序列為5’- CTGTGCTCTGCGGTCTCA-3’，下游引物序列為5’-TTCGTCGTCCCATCAGTC-3’；GADPH 上游引物序列為5’-CTCAGACACCATGGGGAGGTGA-3’，下游引物序列為5’-ATGATCTTGAGGCTGTT GTCATA-3’。

1.7 統計方法 采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，采用GraphPad Prism 5 軟件作圖。計量數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用LSD 法。以P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠骨指標水平比較 圖1 結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠骨體積分數、骨小梁厚度、骨小梁數量顯著降低，骨表面積/骨體積顯著升高（均P ＜0.05）；與模型組比較，雙氫青蒿素低、中、高劑量組大鼠骨體積分數、骨小梁厚度、骨小梁數量升高，骨表面積/骨體積降低，且呈劑量依賴性，其中雙氫青蒿素中、高劑量組差異有統計學意義（均P ＜0.05）。

2.2 各組大鼠踝關節病理學表現比較 圖2 結果顯示：從HE染色結果可見，假手術組大鼠踝關節無炎癥和軟骨損傷，模型組大鼠踝關節滑膜增生，炎性細胞浸潤，軟骨損傷嚴重，使用低、中、高劑量的雙氫青蒿素處理后大鼠踝關節炎性浸潤顯著改善，滑膜增生得到了顯著的改善。從阿利新藍染色結果可見，假手術組大鼠踝關節軟骨組織蛋白多糖有較強表達，模型組大鼠軟骨組織基本無蛋白多糖表達，使用低、中、高劑量的雙氫青蒿素處理后大鼠軟骨組織中蛋白多糖表達顯著增加。從TRAP染色結果可見，與假手術組比較，模型組大鼠踝關節骨組織破骨細胞明顯增多，使用低、中、高劑量的雙氫青蒿素處理后大鼠踝關節骨組織破骨細胞數量較模型組明顯減少。

圖1 各組大鼠骨指標水平比較

Figure 1 Comparison of the levels of bone indexes in rats of various groups

圖2 各組大鼠踝關節病理學表現比較（×400）Figure 2 Comparison of the pathological features of rat ankle tissue in various groups（×400）

2.3 各組大鼠外周血中炎癥相關因子TNF-α、IL-17、IL-23 和IL-10 含量比較 圖3 結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠外周血中炎癥相關因子TNF-α、IL-17、IL-23和IL-10含量均顯著升高（P ＜0.05）；與模型組比較，雙氫青蒿素低、中、高劑量組大鼠外周血中炎癥相關因子TNF-α、IL-17、IL-23含量降低，IL-10含量升高，且呈劑量依賴性，其中雙氫青蒿素中、高劑量組差異有統計學意義（均P ＜0.05）。

圖3 各組大鼠外周血中炎癥相關因子TNF-α、IL-17、IL-23和IL-10表達水平比較Figure 3 Comparison of the levels of inflammation-related factor TNF-α，IL-17，IL-23，IL-10 in rat peripheral blood of various groups

2.4 各組大鼠踝關節組織成骨標記物Osx、COL1A1、OC 表達情況比較 圖4 結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠踝關節組織Osx、COL1A1、OC 的相對表達水平顯著降低（P ＜0.05）；與模型組比較，雙氫青蒿素低、中、高劑量組大鼠踝關節組織Osx、COL1A1、OC 的相對表達水平升高，且呈劑量依賴性，其中雙氫青蒿素中、高劑量組差異有統計學意義（均P ＜0.05）。

2.5 各組大鼠踝關節組織骨吸收功能相關基因OSCAR、TRAP 表達情況比較 圖5 結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠踝關節組織OSCAR、TRAP mRNA 表達水平均顯著升高（P ＜0.05）；與模型組比較，雙氫青蒿素低、中、高劑量組大鼠踝關節組織OSCAR、TRAP mRNA 表達水平均降低，且呈劑量依賴性，其中雙氫青蒿素中、高劑量組差異有統計學意義（均P ＜0.05）。

圖5 各組大鼠踝關節組織骨吸收功能相關基因OSCAR、TRAP表達情況比較Figure 5 Comparison of the expression levels of bone resorption function-related gene OSCAR，TRAP in rat ankle tissue of various groups

3 討論

類風濕關節炎（RA）發病機制復雜，受多種因素的影響，這些因素導致機體免疫調節失衡和過度的炎癥反應，從而引起關節結構的破壞。骨體積分數（骨體積/總量）、骨小梁厚度、骨小梁數量主要反映骨組織的密度[13-15]。本研究結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠骨體積分數、骨小梁厚度、骨小梁數量均顯著降低，骨表面積/骨體積顯著升高（均P ＜0.05）；從HE 染色結果可見，滑膜增生，炎性細胞浸潤，軟骨損傷嚴重；從阿利新藍染色結果可見，軟組織基本無蛋白多糖表達，而經雙氫青蒿素干預后上述情況均得到改善。表明雙氫青蒿素可顯著改善RA軟骨損傷情況并提高骨密度。

RA 滑膜組織中炎癥因子可通過刺激膠原酶和前列腺素E誘導損傷軟骨和骨骼[16]。目前，研究較多的炎癥因子主要包括促炎癥因子和抑炎癥因子，其中，促炎癥因子主要由輔助性T淋巴（TH）1細胞分泌，主要包括TNF-α、IL-17、IL-23 等。抑炎癥因子主要由TH2 細胞分泌，主要包括IL-10、IL-4、IL-13等。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠外周血中炎癥相關因子TNFα、IL-17、IL-23 和IL-10 含量均顯著升高（P ＜0.05），而經雙氫青蒿素干預可以調節上述趨勢，有效抑制促炎癥因子TNF-α、IL-17、IL-23 的升高，促進抑炎癥因子IL-10的分泌，表明雙氫青蒿素可以改善大鼠滑膜組織炎癥反應。

RA 發病伴隨軟骨、骨質損傷。Osx 為鋅指DNA結合蛋白，在骨組織發育中呈高表達，Osx缺失阻礙骨組織形成，是成骨細胞分化和骨形成過程中的重要轉錄因子[17]。COL1A1 是主要由成骨細胞合成的1 型膠原蛋白，為骨基質組成成分，COL1A1可促進膠原成熟、成骨細胞分化、促進礦物鹽沉積，加速骨組織形成[18]。OC 是由成骨細胞合成并分泌的骨鈣素，是成熟骨細胞的主要標志物，在成骨細胞分化、骨基質礦化時水平升高[19]。本研究結果顯示，RA大鼠骨組織Osx、COL1A1和OC 水平顯著降低，而雙氫青蒿素干預可下調升高的Osx、COL1A1和OC水平，表明雙氫青蒿素可以促進RA大鼠軟骨組織修復。

發生RA時，常伴隨著骨質疏松和骨質重塑等過程，此過程涉及破骨細胞、成骨細胞，兩者分別吸收受損舊骨、形成新骨[20]。當破骨細胞增多、成骨細胞減少，則會出現骨密度減少、關節炎的現象[21]。OSCAR 是破骨細胞相關受體，其水平與破骨細胞數量呈正相關，當OSCAR 水平升高時破骨細胞數量增加，反之則是破骨細胞數量減少。TRAP 是抗酒石酸酸性磷酸酶，是破骨細胞的標志酶，為破骨細胞所特有，當TRAP表達缺乏或者過度時會出現骨硬化和骨質疏松[22]。本研究結果顯示，與假手術組比較，RA 大鼠骨組織OSCAR mRNA、TRAP mRNA 相對表達水平顯著升高，且破骨細胞增多，而雙氫青蒿素干預后，OSCAR mRNA、TRAP mRNA相對表達水平顯著降低，且破骨細胞呈降低趨勢，表明雙氫青蒿素可以促進RA大鼠軟骨生長。

綜上所述，雙氫青蒿素可以通過抑制Ⅱ型膠原誘導RA 大鼠炎癥反應，促進軟骨修復，改善RA。