扶肺煎抑制肺癌增殖和轉(zhuǎn)移的體內(nèi)外研究

陳觀平， 汪一帆， 應(yīng)栩華

（浙江省立同德醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤研究所，浙江杭州 310012）

肺癌的高轉(zhuǎn)移性是造成患者高病死率的主要因素，一旦發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者的臨床療效及生存時(shí)間[1]。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)非常復(fù)雜的過程[2]，深入研究肺癌的臨床治療及其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的防治，使之更好地指導(dǎo)臨床應(yīng)用，對降低肺癌病死率，改善臨床預(yù)后有重要意義。扶肺煎為我院多年使用的抗肺癌臨床具有效驗(yàn)方，前期的研究表明，扶肺煎不僅能改善肺癌患者免疫功能、減輕臨床癥狀，還可促進(jìn)抑癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的表達(dá)[3]；扶肺煎可降低C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤Bcl-2 基因的表達(dá)，提高Bax 基因的表達(dá)，起到控制細(xì)胞生長及分化、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[4]。而Bcl-2、Bax為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT3）下游靶基因[5]。為進(jìn)一步探討扶肺煎抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移的作用機(jī)制，本研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察扶肺煎對肺癌細(xì)胞STAT3信號傳導(dǎo)通路的影響，以期為扶肺煎臨床治療肺癌提供理論依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞株A549、SPC-A1購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。人肺癌細(xì)胞株A549、SPC-A1 培養(yǎng)于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱，以含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2 d 傳代1 次，維持細(xì)胞密度為80%左右。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 雄性健康SPF級3 ～4周齡C57BL/6小鼠，體質(zhì)量（18±2）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK（京）2015-0001。雄性健康SPF級6 ～7周齡SD大鼠，體質(zhì)量（180±10）g，購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物質(zhì)量合格證號：Abzz0619067637。所有動物均飼養(yǎng)于浙江省中醫(yī)藥研究院SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心，飼養(yǎng)溫度為20～25 ℃，濕度為40%～70%。

1.3 藥物及制備 扶肺煎方藥組成：生曬參10 g，北沙參12 g，炙黃芪30 g，枸杞子12 g，天葵子12 g，貓爪草20 g，紫花地丁20 g，蜈蚣3 條。上述中藥材均購自杭州華東中藥飲片有限公司，經(jīng)浙江中醫(yī)藥研究院浦錦寶教授鑒定為道地藥材。于浙江省立同德醫(yī)院制劑室煎制，方法：稱取復(fù)方中各藥材后，加入10 倍藥量的水，煎煮2 次（分別為2、1.5 h），收集、合并2次濾液，減壓濃縮至適當(dāng)體積，最終成2 g/mL的藥液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試劑與儀器 RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司）；胎牛血清（美國Gibco 公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8）、放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；兔抗人細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、STAT3、磷酸化STAT3（p-STAT3）單克隆抗體（美國CST 公司）；多聚體抗兔免疫球蛋白G（IgG）-辣根過氧化物酶（HRP）（武漢博士德公司，貨號：SV0002）。蛋白電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher 公司）；PCR儀（美國ABI 公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國MD公司）。

1.5 體外研究

1.5.1 含藥血清的制備 按照中藥血清藥理學(xué)及前期研究基礎(chǔ)[6-7]，將大鼠隨機(jī)分為空白對照組（15 只）、扶肺煎高劑量組（5只）、扶肺煎低劑量組（5 只）。扶肺煎高劑量組按生藥30 g·kg-1·d-1灌胃、扶肺煎低劑量組按生藥15 g·kg-1·d-1灌胃，空白對照組灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃7 d，末次灌胃1 h后無菌條件下取血并分離血清過濾除菌。

1.5.2 細(xì)胞分組 分為5 組。空白對照組：10%空白對照血清+RPMI-1640培養(yǎng)基；扶肺煎低劑量組：10%低劑量組含藥血清+RPMI-1640 培養(yǎng)基；扶肺煎高劑量組：10%高劑量組含藥血清+RPMI-1640培養(yǎng)基；AG490組（陽性對照1）：10%空白對照血清+1640 培養(yǎng)基+10 μmol/L AG490；順鉑組（陽性對照2）：10%空白對照血清+1640 培養(yǎng)基+1 μmol/L 順鉑。

1.5.3 CCK8 法測定細(xì)胞增殖情況 取對數(shù)生長期的A549、SPC-A1細(xì)胞，接種于96孔板，5×103個(gè)/孔，每孔100 μL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后棄上清。按“1.5.2”項(xiàng)方法處理，每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，24、48、72 h 后終止培養(yǎng)。按CCK-8 試劑盒說明書進(jìn)行操作，應(yīng)用酶標(biāo)儀于450 nm 波長處檢測各孔光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。細(xì)胞生長抑制率（%）= [（OD空白血清- OD含藥血清）/（OD空白血清-OD空白）]×100%。

1.5.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移能力 取處于對數(shù)生長期狀態(tài)良好的A549、SPC-A1細(xì)胞，接種于6孔板，待細(xì)胞長至80%左右，按“1.5.2”項(xiàng)方法處理。24 h 后，在每孔板中間用1 mL 槍頭劃痕，使各孔的細(xì)胞劃痕寬度一致，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗去除細(xì)胞碎片。每孔換成含相應(yīng)血清及藥物的培養(yǎng)基2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞遷移情況，并拍照記錄。

1.5.5 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞侵襲能力 將對數(shù)生長期狀態(tài)的A549、SPC-A1細(xì)胞調(diào)整密度為5 × 105個(gè)/mL，種 于6 孔 板，每 孔2 mL，按“1.5.2”項(xiàng)方法處理。24 h 后消化收集細(xì)胞，加入僅含RPMI-1640 的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，各組細(xì)胞均調(diào)整密度為1×106個(gè)/mL，分別取100 μL上述細(xì)胞懸液加入含Matrigel基質(zhì)膠的Transwell 24孔板小室上室。下室加入600 μL 含10%胎牛血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。棄去Transwell 小室中培養(yǎng)液，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，PBS洗滌，40 g/L多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色后拍照并統(tǒng)計(jì)穿過小孔的細(xì)胞。

1.5.6 蛋白免疫印跡法觀察細(xì)胞Cyclin D1、CDK4、STAT3、p-STAT3蛋白的表達(dá) 按“1.5.2”項(xiàng)方法處理A549、SPC-A1細(xì)胞，48 h后裂解細(xì)胞并提取蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，經(jīng)脫脂奶粉封閉，一抗Cyclin D1（1∶1 000 稀釋）4 ℃孵育過夜，二抗IgGHRP（1∶5 000 稀釋）孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色，成像，最后應(yīng)用ImageJ 軟件分析電泳條帶的灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參計(jì)算各組目的蛋白含量。CDK4（1∶1 000）、STAT3（1∶2 000）、p-STAT3（1∶1 000）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（1∶1 000）等抗體的檢測方法同上。

1.6 體內(nèi)研究

1.6.1 造模、分組與干預(yù)方法 取對數(shù)生長期的Lewis 肺癌細(xì)胞，消化、離心后，調(diào)細(xì)胞混懸液濃度為1.0×107個(gè)/mL。于每只小鼠皮下接種細(xì)胞混懸液0.2 mL，建立Lewis 肺癌小鼠模型。24 h 后，隨機(jī)分為4組，即模型組、扶肺煎低劑量組、扶肺煎高劑量組、順鉑組，每組12 只，分籠飼養(yǎng)。根據(jù)成人的臨床用藥劑量換算成相應(yīng)小鼠用藥劑量，其中，高劑量組相當(dāng)于成人等效劑量的20 倍給藥，低劑量組相當(dāng)于成人等效劑量的10 倍給藥。扶肺煎低、高劑量組，分別給予扶肺煎30、60 g·kg-1灌胃，每日1 次；順鉑組，給予順鉑2 mg/kg 腹腔注射，隔日1 次；模型對照組，給予0.5 mL生理鹽水灌胃。連續(xù)14 d。

1.6.2 腫瘤轉(zhuǎn)移情況與抑瘤率 末次給藥后24 h頸椎脫臼法處死小鼠，取肺，肉眼觀察肺轉(zhuǎn)移灶，計(jì)算肺部轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)，計(jì)算肺轉(zhuǎn)移抑制率，肺轉(zhuǎn)移抑制率（%）=（模型組平均轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)-治療組平均轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)）/模型組平均轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)× 100%。同時(shí)剝瘤并稱質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率（%）=（對照組平均瘤質(zhì)量-治療組平均瘤質(zhì)量）/對照組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.6.3 免疫組織化學(xué)法檢測移植瘤組織Cyclin D1、CDK4、p-STAT3 表達(dá) 將剝離的移植瘤固定12 h后，常規(guī)石蠟包埋切片。清除內(nèi)源性過氧化酶后熱修復(fù)抗原。滴加單抗p-STAT3（1∶200稀釋）37 ℃孵育，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染后鏡檢。陽性表達(dá)胞漿呈棕黃色顆粒狀染色，每張片子隨機(jī)抽取5個(gè)高倍鏡視野（×200）采集圖像，用Image Pro Plus 6.0軟件分析測定每個(gè)視野積分光密度（IOD）。Cyclin D1（1∶250）、CDK4（1∶800）檢測方法同上。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 扶肺煎含藥血清對A549、SPC-A1 細(xì)胞增殖的影響 表1 結(jié)果顯示：干預(yù)A549 細(xì)胞48 h 后，扶肺煎低、高劑量組，AG490組，順鉑組的OD值較空白對照組降低（P ＜0.05 或P ＜0.01）；干預(yù)A549 細(xì)胞72 h 后，扶肺煎高劑量組、AG490 組、順鉑組的OD 值較空白對照組降低（P ＜0.05 或P ＜0.01）。表2 結(jié)果顯示：干預(yù)SPC-A1 細(xì)胞48 h 后，扶肺煎高劑量組、AG490組的OD值較空白對照組降低（P ＜0.05）；干預(yù)SPC-A1細(xì)胞72 h后，AG490組、順鉑組的OD值較空白對照組降低（P ＜0.05或P ＜0.01）。表明扶肺煎可抑制A549、SPC-A1細(xì)胞的增殖，抑制A549 細(xì)胞的效果優(yōu)于SPC-A1 細(xì)胞，且隨扶肺煎含藥血清處理時(shí)間的延長，干預(yù)作用逐漸減弱，48 h作用效果較好。

表1 扶肺煎含藥血清對A549細(xì)胞增殖的影響Table 1 Effect of Fufei Jian-containing serum on proliferation of A549 cells （±s）

表1 扶肺煎含藥血清對A549細(xì)胞增殖的影響Table 1 Effect of Fufei Jian-containing serum on proliferation of A549 cells （±s）

①P ＜0.05，②P ＜0.01，與空白對照組比較

組別空白對照組扶肺煎低劑量組扶肺煎高劑量組AG490組順鉑組干預(yù)24 h OD值1.02±0.02 0.97±0.02 0.91±0.04 0.88±0.02 0.87±0.03抑制率（%）0 5.29±0.04 10.6±0.01 13.9±0.03 14.9±0.02干預(yù)48 h OD值1.59±0.03 1.34±0.05①1.25±0.04①1.19±0.06②1.21±0.05①抑制率（%）0 15.8±0.02 21.3±0.01 25.4±0.04 23.3±0.03干預(yù)72 h OD值2.24±0.06 1.97±0.08 1.82±0.00①1.67±0.06②1.61±0.05②抑制率（%）0 12.3±0.01 18.6±0.04 25.0±0.07 27.9±0.06

表2 扶肺煎含藥血清對SPC-A1細(xì)胞增殖的影響Table 2 Effect of Fufei Jian-containing serum on proliferation of SPC-A1 cells （±s）

表2 扶肺煎含藥血清對SPC-A1細(xì)胞增殖的影響Table 2 Effect of Fufei Jian-containing serum on proliferation of SPC-A1 cells （±s）

①P ＜0.05，②P ＜0.01，與空白對照組比較

組別空白對照組扶肺煎低劑量組扶肺煎高劑量組AG490組順鉑組干預(yù)24 h OD值0.85±0.03 0.80±0.02 0.73±0.03 0.70±0.01 0.71±0.02抑制率（%）0 5.1±0.03 13.0±0.03 16.9±0.02 15.5±0.03干預(yù)48 h OD值1.46±0.04 1.28±0.03 1.14±0.04①1.15±0.06①1.24±0.03抑制率（%）0 12.0±0.02 21.8±0.01 21.0±0.04 15.0±0.03干預(yù)72 h OD值2.07±0.06 1.94±0.04 1.84±0.05 1.55±0.04②1.60±0.06①抑制率（%）0images/BZ_154_797_2053_799_2056.png0.06±0.06 11.1±0.01 25.4±0.03 22.7±0.04

2.2 扶肺煎含藥血清對A549、SPC-A1 細(xì)胞遷移的影響 圖1結(jié)果顯示：扶肺煎高劑量組、AG490組、順鉑組處理A549、SPC-A1細(xì)胞劃痕24 h后劃痕依舊明顯，寬度變化不明顯，而空白對照組劃痕區(qū)變窄。A549 細(xì)胞，與空白對照組比較，扶肺煎低、高劑量組，AG490 組、順鉑組細(xì)胞遷移距離明顯縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；SPC-A1細(xì)胞，與空白對照組比較，扶肺煎高劑量組、AG490 組、順鉑組的細(xì)胞遷移距離均明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。表明扶肺煎均可抑制A549、SPC-A1細(xì)胞的遷移。

2.3 扶肺煎含藥血清對A549、SPC-A1 細(xì)胞侵襲能力的影響 圖2 結(jié)果顯示：A549 細(xì)胞，與空白對照組比較，扶肺煎低、高劑量組，AG490 組，順鉑組細(xì)胞遷移數(shù)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；SPC-A1 細(xì)胞，與空白對照組比較，扶肺煎高劑量組、AG490 組、順鉑組的細(xì)胞遷移數(shù)量均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。表明扶肺煎均可抑制A549、SPC-A1 細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

2.4 扶肺煎含藥血清對A549、SPC-A1 細(xì)胞Cyclin D1、CDK4 蛋白表達(dá)的影響 圖3 結(jié)果顯示：A549 細(xì)胞，與空白對照組比較，扶肺煎低、高劑量組，AG490 組，順鉑組的Cyclin D1 蛋白表達(dá)水平明顯降低，扶肺煎高劑量組及AG490 組的CDK4蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05或P ＜0.01）；SPC-A1細(xì)胞，與空白對照組比較，扶肺煎低、高劑量組，AG490 組、順鉑組的Cyclin D1、CDK4 蛋白表達(dá)水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。表明扶肺煎可能通過抑制Cyclin D1、CDK4 的表達(dá)，抑制A549、SPC-A1細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

2.5 扶肺煎含藥血清對A549、SPC-A1細(xì)胞STAT3、p-STAT3 的影響 圖4 結(jié)果顯示：A549、SPC-A1細(xì)胞各組STAT3 表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。A549 細(xì)胞，扶肺煎高劑量組、AG490 組、順鉑組的p-STAT3 表達(dá)水平較空白對照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）；SPC-A1 細(xì)胞，扶肺煎高劑量組、AG490 組、順鉑組的p-STAT3 表達(dá)水平較空白對照組明顯降低，但扶肺煎高劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。表明扶肺煎可能通過抑制STAT3磷酸化，減輕A549、SPC-A1 細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，對A549細(xì)胞的抑制作用更強(qiáng)。

圖1 扶肺煎含藥血清對A549、SPC-A1細(xì)胞遷移的影響Figure 1 Effect of Fufei Jian-containing serum on migration of A549 and SPC-A1 cells

圖2 扶肺煎含藥血清對A549、SPC-A1細(xì)胞侵襲的影響Figure 2 Effect of Fufei Jian-containing serum on invasion of A549 and SPC-A1 cells

圖3 扶肺煎含藥血清對A549、SPC-A1細(xì)胞Cyclin D1、CDK4蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effect of Fufei Jian-containing serum on protein expression levels of Cyclin D1 and CDK4 in A549 and SPC-A1 cells

圖4 扶肺煎含藥血清對A549、SPC-A1細(xì)胞STAT3、p-STAT3的影響Figure 4 Effect of Fufei Jian-containing serum on the protein expression levels of STAT3 and p-STAT3 in A549 and SPC-A1 cells

2.6 扶肺煎對Lewis荷瘤小鼠移植瘤生長、肺轉(zhuǎn)移情況的影響 圖5、表3 結(jié)果顯示：扶肺煎低、高劑量組及順鉑組Lewis荷瘤小鼠瘤質(zhì)量較模型組明顯減小（P ＜0.01），抑瘤率分別為46.81%、78.72%、76.60%；扶肺煎高劑量組、順鉑組的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量較模型組明顯減少（P ＜0.01），肺轉(zhuǎn)移抑制率分別為0.82%、28.76%、33.82%。表明扶肺煎可抑制Lewis荷瘤小鼠移植瘤生長與肺轉(zhuǎn)移。

2.7 扶肺煎對Lewis 荷瘤小鼠肺臟病理形態(tài)學(xué)的影響 圖6 結(jié)果顯示：模型組Lewis 荷瘤小鼠肺泡壁存在損傷、斷裂，且細(xì)胞浸潤增加；肺泡間隙中性粒細(xì)胞增多，肺部存在腫瘤轉(zhuǎn)移小結(jié)節(jié)；轉(zhuǎn)移的腫瘤由長梭形或短梭形細(xì)胞形成，呈編織狀排列；細(xì)胞核橢圓形，色深，核仁不明顯，胞漿豐富。扶肺煎高劑量組上述情況相對較好。表明Lewis 荷瘤小鼠存在肺轉(zhuǎn)移，扶肺煎可減輕Lewis荷瘤小鼠的肺轉(zhuǎn)移。

2.8 扶肺煎對Lewis荷瘤小鼠移植瘤組織Cyclin D1、CDK4 蛋白表達(dá)的影響 圖7 結(jié)果顯示：與模型組比較，扶肺煎高劑量組及順鉑組移植瘤組織Cyclin D1、CDK4蛋白表達(dá)水平均降低（P ＜0.05或P ＜0.01），表明扶肺煎可抑制Lewis 荷瘤小鼠移植瘤細(xì)胞增殖。

圖5 各組Lewis荷瘤小鼠移植瘤大小比較Figure 5 Comparison of the Xenograft tumors size in Lewis tumor-bearing mice of various groups

表3 各組Lewis荷瘤小鼠移植瘤生長、肺轉(zhuǎn)移情況比較Table 3 Comparison of the Xenograft tumors growth and lung metastasis in Lewis tumor-bearing mice of various groups （±s）

表3 各組Lewis荷瘤小鼠移植瘤生長、肺轉(zhuǎn)移情況比較Table 3 Comparison of the Xenograft tumors growth and lung metastasis in Lewis tumor-bearing mice of various groups （±s）

①P ＜0.01，與模型組比較

組別模型組扶肺煎低劑量組扶肺煎高劑量組順鉑組瘤質(zhì)量（g）0.47±0.07 0.25±0.05①0.10±0.04①0.11±0.06①抑瘤率（%）—46.81 78.72 76.60肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)（個(gè)）6.12±1.06 6.07±0.35 4.36±0.57①4.05±0.76①肺轉(zhuǎn)移抑制率（%）—0.82 28.76 33.82

圖6 扶肺煎對Lewis荷瘤小鼠肺臟病理形態(tài)學(xué)的影響（HE染色，×100）Figure 6 Effect of Fufei Jian on the pathological features of lung tissue in Lewis tumor-bearing mice of various groups（HE staining，×100）

2.9 扶肺煎對Lewis荷瘤小鼠移植瘤組織p-STAT3表達(dá)的影響 圖8結(jié)果顯示：與模型組比較，扶肺煎低、高劑量組及順鉑組移植瘤組織p-STAT3 蛋白表達(dá)水平均降低（P ＜0.05 或P ＜0.01），表明扶肺煎可能通過抑制STAT3 蛋白的活化發(fā)揮抑制腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移的作用。

3 討論

扶肺煎為本院效驗(yàn)多年的抗肺癌驗(yàn)方。方中：生曬參益氣補(bǔ)正，北沙參養(yǎng)陰生津，并為君藥；黃芪助生曬參補(bǔ)氣，枸杞子助北沙參養(yǎng)陰，貓爪草祛肺毒，俱為臣藥；復(fù)以蜈蚣清熱，紫花地丁散結(jié)，天葵子散瘀，兼具解毒之效，均系佐藥。諸藥伍用，共收扶正補(bǔ)虛、養(yǎng)陰解毒之功。由于A549 細(xì)胞具有較高的增殖、侵襲遷移能力[8]，而SPC-A1侵襲遷移能力相對較弱[9]，故本研究選擇A549、SPC-A1細(xì)胞株為研究對象觀察扶肺煎對其抑制作用，對扶肺煎抗腫瘤的藥理學(xué)機(jī)制進(jìn)行評價(jià)。本研究結(jié)果表明，扶肺煎可抑制A549、SPC-A1 細(xì)胞的增殖，抑制A549 細(xì)胞的效果優(yōu)于抑制SPC-A1 細(xì)胞的效果，且可抑制2 種細(xì)胞的遷移、侵襲，提示扶肺煎可能對A549細(xì)胞更為敏感。

圖7 各組Lewis小鼠肺癌移植瘤組織Cyclin D1、CDK4蛋白表達(dá)比較Figure 7 Effect of Fufei Jian on the protein expression levels of Cyclin D1 and CDK4 in Xenograft tumor tissue from Lewis tumor-bearing mice

圖8 扶肺煎對Lewis荷瘤小鼠移植瘤組織p-STAT3表達(dá)的影響Figure 8 Effect of Fufei Jian on the protein expression level of p-STAT3 in Xenograft tumor tissue from Lewis tumorbearing mice

Lewis 肺癌模型廣泛應(yīng)用于癌轉(zhuǎn)移機(jī)制及抗腫瘤藥物的篩選與干預(yù)研究，是理想的動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀１狙芯拷Y(jié)果顯示：在Lewis 肺癌移植瘤小鼠中，扶肺煎高劑量組及順鉑組具有較高的抑瘤率及肺轉(zhuǎn)移抑制率；各組小鼠肺部均存在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，其中，模型組肺泡壁存在損傷、斷裂，且細(xì)胞浸潤增加，扶肺煎高劑量組情況相對較好。表明扶肺煎對Lewis肺癌移植瘤具有一定的抑制作用。

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)非常復(fù)雜的過程。腫瘤細(xì)胞會侵入周圍的細(xì)胞，破壞正常組織的抗癌機(jī)制，經(jīng)過突變、激增等過程之后最終擴(kuò)散至各個(gè)健康組織。有研究表明，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，Cyclin D1扮演著重要角色[10]。Cyclin D1 蛋白是由原癌基因CCNDl 編碼的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，癌基因STAT3等可誘導(dǎo)癌細(xì)胞Cyclin D1 蛋白的表達(dá)，與CDK4、CDK6 形成復(fù)合物Cyclin D1/CDK4、CDK6，使Rb蛋白磷酸化，驅(qū)動細(xì)胞從G1 期進(jìn)入S 期[11]。本研究結(jié)果顯示，無論體外還是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，扶肺煎均可降低Cyclin D1、CDK4蛋白的表達(dá)水平，表明其對腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控蛋白具有較好的抑制效果。

STAT3在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和浸潤、轉(zhuǎn)移中起著重要的調(diào)控作用。正常生理情況下，STAT3的表達(dá)是一個(gè)瞬時(shí)過程，一般呈微弱表達(dá)[12]。而STAT3 的持續(xù)高表達(dá)往往引起正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[13]，STAT3 磷酸化并被激活后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，通過SH2 結(jié)構(gòu)域與Cyclin D1 啟動子上的STAT3 位點(diǎn)結(jié)合而啟動Cyclin D1 基因的表達(dá)[14]，同時(shí)也促進(jìn)抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL[15-17]等表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，使弱轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦咿D(zhuǎn)移癌細(xì)胞，并增加其在體內(nèi)的癌轉(zhuǎn)移。而AG490 作為STAT3 的抑制劑，可通過抑制STAT3的活化從而抑制腫瘤增殖[18]。本研究結(jié)果顯示，扶肺煎可下調(diào)磷酸化STAT3 的體內(nèi)外表達(dá)水平，效果接近STAT3 的抑制劑AG490。提示扶肺煎在體內(nèi)可能通過抑制STAT3 的磷酸化水平，從而起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖及遷移的作用。

綜上所述，肺癌是目前人類發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，侵襲和轉(zhuǎn)移是肺癌患者死亡的重要原因。STAT3信號通路、細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的變化是非小細(xì)胞肺癌研究的一項(xiàng)重要內(nèi)容。本研究結(jié)果表明，扶肺煎能夠通過抑制STAT3 蛋白的活化，降低Cyclin D1、CDK4的表達(dá)，起到控制腫瘤細(xì)胞生長及分化的作用，從而干預(yù)腫瘤轉(zhuǎn)移的形成，結(jié)合其臨床應(yīng)用價(jià)值，值得進(jìn)一步深入研究。