丹參多酚酸鹽減輕糖尿病腎病小鼠腎纖維化的機制研究

楊冰， 高飛， 劉令今， 張堯， 張翠輕， 檀淼， 檀金川

（1.河北中醫學院研究生學院，河北石家莊 050000；2.河北中醫學院第一附屬醫院腎病一科，河北石家莊 050000；3.河北醫科大學第四醫院內分泌科，河北石家莊 050000）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是引起終末期腎病的主要原因，占全球范圍內終末期腎病的30% ～50%[1]，而導致DN 的發生發展是多種病理變化共同的結果，包括細胞外基質蛋白沉積、腎小球基底膜增厚以及電荷屏障丟失、腎小球系膜基質擴張、足突融合消失和足細胞丟失等[2-4]。DN 的發展不僅需要控制血糖升高這一源頭，更應警惕疾病發生過程中并發的腎組織纖維化的進展。臨床研究顯示，丹參多酚酸鹽在改善糖尿病患者的早期炎癥反應中具有確切的療效，還可以改善腎功能相關指標以及減輕腎組織纖維化的病理程度，從而延緩慢性腎臟疾病的進展[5-7]。本課題組在前期實驗研究中發現，丹參多酚酸鹽可以有效抑制或減少膜性腎病大鼠腎小球基底膜免疫復合物的沉積及基底膜的增厚，延緩腎病進展[8-9]。在此基礎上，本研究以DN小鼠為模型，進一步從分子水平探討丹參多酚酸鹽改善DN小鼠腎纖維化的可能機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 8周齡清潔級雄性C57BL/6小鼠60只，體質量（20±2）g，購自河北醫科大學動物實驗中心，動物質量合格證號：SCXK（冀）2018-004。飼養于河北中醫學院實驗動物中心（室溫、濕度、光照適宜），普通飼料喂養。

1.3 儀器 穩豪型血糖儀（強生有限公司）；7170A 全自動生化分析儀（日本日立公司）；Eco 實時定量PCR儀（美國Illumina 公司）；1-15K高速冷凍離心機（美國Sigma 公司）；RM-2126RT 型切片機（上海徠卡儀器有限公司）；CU600恒溫水浴震蕩器（姜堰市醫療器械有限公司）；BX53光學顯微鏡（日本Olympus 公司）；DYCZ-24D 型垂直電泳槽（北京六一公司）； Mini-PROTEAN3 電泳系統、Mini Trans-Blot轉移系統（美國伯樂公司）。

1.4 分組、造模及給藥 將60只小鼠稱定體質量并編號按隨機數字表隨機分為4組，即正常組、模型組、貝那普利組、丹參多酚酸鹽組，每組各15 只。適應性喂養1周后，通過連續5 d腹腔注射40 mg·kg-1STZ（溶于0.1 mol/L 檸檬酸緩沖液，pH = 4.0）建立DN 小鼠模型。腹腔注射STZ 5 d 后檢測血糖水平，若血糖＞16.7 mmol·L-1則可判斷糖尿病模型復制成功，此后每周監測小鼠血糖和24 h尿微量蛋白（24-hour urinary microprotein，UMP）水平。8 周后以UMP ＞30 mg 為DN 模型成功標準[10]。成功造模后，按照成人用藥的配伍比例及小鼠與成人的體表面積換算法[11]計算小鼠給藥劑量。丹參多酚酸鹽組：將注射用丹參多酚酸鹽與0.1 mL 生理鹽水配成溶液后腹腔注射，劑量為25.9 mg/kg（相當于等效成人劑量200 mg/d），再給予0.2 mL蒸餾水灌胃；貝那普利組：將貝那普利磨成細粉溶于0.2 ml 蒸餾水中灌胃，劑量為1.30 mg/kg（相當于成人10 mg/d），再給予0.1 mL 生理鹽水腹腔注射；正常組和模型組：給予等體積蒸餾水灌胃及等體積生理鹽水腹腔注射。每日1 次，連續4 周。實驗期間各組小鼠均有死亡。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 生化指標測定 采用終點法檢測尿蛋白濃度，24 h 尿蛋白總量（24h UTP）=尿蛋白濃度×24 h尿量。所有大鼠禁食8 h后尾靜脈采血，血糖分析儀檢測空腹血糖（FBG）。眼球取血，采用全自動生化分析儀按試劑盒說明方法操作檢測血清肌酐（SCr）、BUN水平。

1.5.2 酶聯免疫吸附分析（ELISA）檢測腎臟組織氧化應激因子SOD、GSH-Px活性及MDA含量 取小鼠腎臟組織勻漿上清液，根據SOD、GSH-Px、MDA ELISA 試劑盒說明書，應用酶標儀于450 nm波長處測定SOD 吸光度值，采用可見分光光度計于420 nm波長處測定GSH-Px吸光度值、于532 nm波長處測定MDA吸光度值。

1.5.3 過碘酸六胺銀（PASM）和Masson 染色法觀察腎臟病理學變化 用40 g/L的多聚甲醛固定液固定腎組織，常規乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（厚度2 μm）、二甲苯脫蠟、乙醇梯度水化后，PASM、Masson 染色，封片，光學顯微鏡下放大400倍采集圖像。

1.5.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測小鼠腎臟組織p-Smad2/3、Smad2/3、Smad7 蛋白表達情況 稱取100 mg 腎組織，剪碎后置于EP 管內，加入裂解液含細胞酶抑制劑提取蛋白，并測定蛋白含量。取上樣蛋白10 ～15 μg，電泳，轉膜。室溫下用50 g/L 脫脂牛奶封閉。加入一抗，4 ℃孵育過夜。加入二抗，37 ℃孵育1 h。顯影。所得結果與內參校正和比較。

1.5.5 逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測Smad7、Smad2/3、TGF-β1 mRNA 表達水平 根據說明書，用TRIzol 試劑提取腎臟總RNA，并用PrimeScript 試劑盒進行反轉錄成cDNA。將cDNA放于熒光定量PCR儀擴增。擴增條件：95 ℃10 min、95 ℃15 s、60 ℃60 s，循環40 次。使用2△△CT法計算目的基因mRNA 表達水平，以β-actin 為內參。引物由北京Servicebio 公司設計合成。β-actin上游引物序列為5’-AGGCCAACCGTGAAAAGATG-3’，下游引物序列為5’-ACCAGAGGCATACAGGG ACAA-3’，擴增片段長度為266 bp；Smad2 上游引物序列為5’-AGGAACAAAAGGTCCGGGGC-3’，下游引物序列為5’-CACTGGCGGAGTGAATGGC A-3’，擴增片段長度為142 bp；Smad3上游引物序列為5’-GGACGCCTGGGCAAGTTCTC-3’，下游引物序列為5’-ATGGACGACATGGCTGGCAC-3’，擴增片段長度為145 bp；Smad7 上游引物序列為5’-CGCGACGAAGAGAGTCTCGG-3’，下游引物序列為GCTGGGGCTGCTCGCATAAG-3’，擴增片段長度為102 bp；TGF-β1 上游引物序列為5’-CGTGCTAATGGTGGACCGCA-3’，下游引物序列為5’-GCAATGGGGGTTCTGGCACT-3’，擴增片段長度為119 bp。

俗話說：“愛子愛在心里。”然而，他愛子是愛在臉上的。有一次，我應邀在其老家作客，吃飯時，大人還沒有動筷子，他的大兒子卻大口大口地先吃起來，還說：“這是我要吃的，你們不能吃！”一點規矩都沒有。然鄭君只是輕描淡寫地說一句：“老大！客人在，你收斂些好嗎！”飯后，我和鄭君正在品茶談天，突然，有一孩子哭著來告狀，說是他額頭上的烏青塊是鄭君的大兒子用磚頭砸的。鄭君連句安慰他的話都沒有，卻反問那個孩子：“他為什么砸你，而不砸別人呢?”這無疑是在默認、縱容其子的錯誤行為。

1.6 統計方法 采用SPSS 23.0 統計軟件處理數據，所選指標均為計量資料，以均數± 標準差（± s）表示。若數據符合正態分布，組間比較采用單因素方差分析，若數據不滿足正態性假設或方差不齊時，則選用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠一般情況 正常組小鼠毛色光澤，活動自然，飲食飲水量及尿量正常；模型組小鼠毛色晦暗，體質量逐漸下降，出現明顯多飲、多食、多尿等表現，造模第6周末，模型組有1只小鼠血糖不達標，予以剔除；丹參多酚酸鹽組第6周死亡1只；貝那普利組第7周死亡1只。

2.2 各組小鼠FBG、UTP、BUN、SCr 水平的比較 表1結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠的FBG、UTP 水平明顯升高（P ＜0.05），BUN 和SCr變化不明顯，差異無統計學意義（P ＞0.05），提示DN小鼠腎功能受到了損傷；與模型組比較，丹參多酚酸鹽組和貝那普利組的UTP 水平顯著降低（P ＜0.05），FBG、BUN、SCr 水平無顯著變化（P ＞0.05），且2 個治療組之間比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。表明丹參多酚酸鹽組小鼠的腎功能損傷可能得到了改善。

2.3 各組小鼠腎組織中SOD、MDA、GSH-Px水平的比較 表2結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠腎組織中MDA 含量顯著升高，SOD 和GSH-Px活性下降，差異均有統計學意義（P ＜0.05），提示DN 小鼠體內產生了氧化應激反應；與模型組比較，丹參多酚酸鹽組和貝那普利組小鼠腎組織中MDA含量不同程度地降低，SOD和GSH-Px活性升高，差異均有統計學意義（P ＜0.05），且2 個治療組之間比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。表明丹參多酚酸鹽能夠有效抑制DN小鼠腎臟組織的氧化應激反應。

表1 各組小鼠FBG、UTP、BUN和SCr水平的比較Table 1 Comparison of the levels of FBG，UTP，BUN and SCr in various groups （±s）

表1 各組小鼠FBG、UTP、BUN和SCr水平的比較Table 1 Comparison of the levels of FBG，UTP，BUN and SCr in various groups （±s）

①P ＜0.05，與正常組比較；②P ＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組貝那普利組丹參多酚酸鹽組鼠數（只）15 14 14 14 FBG（mmol·L-1）5.32±0.53 27.03±2.67①27.09±3.11①27.12±3.22①UTP（mg·24h-1）2.34±0.15 7.54±0.48①5.37±0.22②4.16±0.18②BUN（mmol·mL-1）10.51±1.54 9.83±1.33 8.84±1.70 9.32±1.56 SCr（μmol·L-1）57.68±3.56 58.24±8.74 54.37±7.72 56.87±6.81

表2 各組小鼠腎組織中SOD、MDA、GSH-Px水平的比較Table 2 Comparison of the levels of SOD，MDA and GSH-Px in mouse renal tissue of various groups （±s）

表2 各組小鼠腎組織中SOD、MDA、GSH-Px水平的比較Table 2 Comparison of the levels of SOD，MDA and GSH-Px in mouse renal tissue of various groups （±s）

①P ＜0.05，與正常組比較；②P ＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組貝那普利組丹參多酚酸鹽組鼠數（只）15 14 14 14 SOD（kU·g-1）133.00±11.03 83.54±9.63①101.47±9.59②115.87±10.45②MDA（μmol·g-1）1.19±0.12 1.84±0.18①1.56±0.20②1.44±0.21②GSH-Px（kU·g-1）604.81±53.17 411.78±33.74①490.24±35.95②543.66±39.46②

2.4 各組小鼠腎組織病理變化的比較 圖1 中PASM 染色結果顯示：正常組小鼠腎內結構較清晰，形狀規則，基底膜未見增厚；模型組可見腎小球基底膜增厚，系膜區明顯增寬，細胞外基質累積；與模型組比較，丹參多酚酸鹽組和貝那普利組小鼠腎組織的病理改變有所減輕。

Masson 染色結果顯示：正常組小鼠腎組織球管形體結構清晰無明顯異常；與正常組比較，模型組腎小球基底膜顯著增厚，有較多的免疫復合物堆積，膠原纖維增多；丹參多酚酸鹽組和貝那普利組的病理改變較模型組減輕，2個治療組之間無明顯差異。

2.5 各組小鼠腎組織p-Smad2/3、Smad2/3、Smad7蛋白表達情況比較 圖2 結果顯示，與正常組比較，模型組的p-Smad2/3 與Smad2/3 比值升高（P ＜0.05），Smad7 蛋白表達明顯減弱（P ＜0.05），表明DN 小鼠體內TGF-β1/Smad 信號轉導通路被激活。與模型組比較，丹參多酚酸鹽組與貝那普利組的p-Smad2/3 與Smad2/3 比值下降（P ＜0.05），Smad7蛋白表達明顯增強（P ＜0.05）。表明丹參多酚酸鹽可抑制DN小鼠腎組織發生TGF-β1/Smad信號轉導通路活化。

2.6 各組小鼠腎組織Smad2/3、Smad7、TGF-β1 mRNA表達水平的比較 表3結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠腎組織中Smad2/3、TGF-β1mRNA表達水平明顯升高，Smad7 mRNA表達水平明顯下降（均P ＜0.05）；與模型組比較，丹參多酚酸鹽組和貝那普利組均可下調小鼠腎組織中Smad2/3、TGF-β1 mRNA 表達水平，上調Smad7 mRNA 表達水平（均P ＜0.05），且2 個治療組之間比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。表明丹參多酚酸鹽可抑制DN小鼠腎組織TGF-β1/Smad信號轉導通路Smad2/3、Smad7、TGF-β1 mRNA的表達。

圖1 各組小鼠腎組織病理形態的比較（PASM、Masson染色，×400）Figure 1 Comparison of the mouse renal pathological changes in various groups（by PASM and Masson staining，×400）

圖2 各組小鼠腎組織p-Smad2/3、Smad2/3、Smad7蛋白表達情況比較（±s）Figure 2 Comparison of the protein expression levels of p-Smad2/3，Smad2/3 and Smad7 in mouse renal tissue of various groups（±s）

表3 各組小鼠腎組織中Smad2/3、Smad7、TGF-β1 mRNA表達水平比較Table 3 Comparison of the mRNA levels of Smad2/3，Smad7and TGF-β1 in mouse renal tissue of various groups （±s）

表3 各組小鼠腎組織中Smad2/3、Smad7、TGF-β1 mRNA表達水平比較Table 3 Comparison of the mRNA levels of Smad2/3，Smad7and TGF-β1 in mouse renal tissue of various groups （±s）

①P ＜0.05，與正常組比較；②P ＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組貝那普利組丹參多酚酸鹽組鼠數（只）15 14 14 14 Smad2/3 1.00±0.00 2.67±0.38①1.76±0.26②1.44±0.22②Smad7 1.00±0.00 0.31±0.04①0.62±0.05②0.71±0.06②TGF-β1 1.00±0.00 4.33±0.64①2.47±0.35②2.12±0.26②

3 討論

糖尿病腎病（DN）是繼發于糖尿病的一種微血管并發癥，其主要臨床表現為蛋白尿、高血壓和腎功能逐漸下降。DN 是一種多因素進展性疾病，其發病機制極其復雜，主要涉及遺傳因素、腎臟血流動力學異常、高血糖導致的糖代謝紊亂、氧化應激、炎性反應和細胞因子以及自噬等[12]。在臨床上，及時避免糖尿病發展成為DN，延緩腎衰竭，防止纖維化是我們亟需解決的問題。

轉化生長因子β1（TGF-β1）/Smad 信號在激活腎小管間質中過量生成細胞外基質的成肌纖維細胞中起重要作用[13]。研究表明，TGF-β1/Smad信號傳導可以誘導腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞轉化，以及募集和誘使骨髓來源的纖維細胞轉化成肌纖維母細胞[14]。TGF-β1 是成纖維因子，可通過激活成纖維細胞并抑制基質降解來促進細胞外基質積累[15-16]，也是DN 發病機制的最后共同通路。有研究證實，在DN 患者中，血清及尿中TGF-β1水平均增高，因此，下調TGF-β1信號表達可能是抗腎纖維化治療的有希望的靶標[17-19]。Smad蛋白是目前所知的TGF-β1受體唯一的胞內激酶底物，介導了胞內信號傳導，參與信號通路傳導的有Smad2、Smad3、Smad4、Smad6、Smad7 等。在誘導的DN 小鼠腎臟病變過程中，Smad2 和Smad3、磷酸化的Smad2/3與Smad4結合并轉移到細胞核中以調節靶基因的轉錄。TGF-β1 信號通路中的Smad7是主要的負性調節因子[20]，對糖尿病腎損傷具有保護作用，在一定程度上對TGF-β1/Smad 信號傳導通路具有負反饋調節作用，其抑制TGF-β1/Smad信號通路已得到公認[21-25]。另外，糖尿病長期的高血糖狀態可破壞活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產生與清除之間的動態平衡，導致機體氧化應激的發生，而氧化應激是DN中一個重要的發病環節[26-27]。有研究[28]證明，ROS 可以激活TGF-β1，糖尿病ROS 水平增高的同時伴隨著TGF-β1 水平的明顯增高。本研究結果顯示，DN模型小鼠腎組織SOD、GSH-Px活性，Smad7 mRNA和蛋白表達水平均較正常組降低，MDA 含量、Smad2/3 的活化水平、TGF-β1 mRNA 表達水平均較正常組升高。表明DN小鼠體內發生氧化應激反應及TGF-β1/Smad信號通路的活化。

中醫學并沒有“糖尿病”“糖尿病腎病”病名。根據糖尿病的臨床表現，中醫學將其歸屬“消渴”范疇，其病機關鍵在于陰虛內熱，而多數醫家認為本病在發生發展過程中，形成了本虛標實的病理特征。根據DN的臨床表現，可歸為“水腫”“關格”“癃閉”“溺毒”等范疇。現代醫家認為DN腎纖維化多是腎絡瘀阻的結果，當外感濁毒之邪，與內生之邪相合，伏于腎絡，阻遏氣機，血行凝滯，瘀血內生，痹阻腎絡，致腎絡瘀阻。濕濁瘀血等病理產物堆積，表現為膠原基質沉積增多；痰濕、濁毒、瘀血等一些病理產物損害了腎臟的正常組織結構，表現為細胞的損傷、凋亡，以及數量的減少；疾病進一步發展則癥瘕形成，可表現為腎小球硬化或腎間質纖維化。

丹參，為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.干燥根及根莖。其味苦，性微寒，入心、肝經，具有活血祛瘀、安神寧心的功效，常用于治療冠心病心絞痛、癥瘕積聚、心悸、失眠等病癥。丹參多酚酸鹽是從丹參中提取的有效成分，其主要的活性物質為丹參乙酸鎂。為觀察糖尿病腎結構和功能變化及丹參多酚酸鹽的干預作用，本研究構建了DN小鼠模型，結果顯示：模型組小鼠腎臟功能指標UTP、SCr、BUN 水平升高，腎臟組織可見腎小球基底膜增厚，系膜區明顯增寬，細胞外基質累積等病理改變，說明DN小鼠出現不同程度的腎結構和功能損害。經丹參多酚酸鹽干預后，DN小鼠腎臟功能指標有所降低，受損的腎組織得到明顯改善。表明丹參多酚酸鹽可以有效改善DN 小鼠腎臟病理損傷，從而調節DN 小鼠的腎臟功能。另外，本研究結果還顯示，丹參多酚酸鹽可以增加DN 小鼠腎組織抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性，降低組織和細胞中氧化產物MDA的蓄積，上調腎組織Smad7 的mRNA 蛋白的表達。表明丹參多酚酸鹽可改善DN小鼠體內發生氧化應激反應及TGF-β1/Smad 信號通路的活化狀態，最終改善糖尿病小鼠的腎臟病理學改變和腎臟功能。

綜上所述，丹參多酚酸鹽可以改善DN小鼠腎功能損傷，其潛在機制可能與抑制TGF-β1/Smad信號傳導，減少下游轉錄蛋白膠原的生成，以及抗氧化應激反應，從而減輕腎纖維化有關。本研究結果為丹參多酚酸鹽臨床治療DN提供了理論基礎。