IL-1β輔助小膠質細胞M1型活化的作用機制研究

沈和平 官俏兵 楊毅 郭麗 盛泳佳 韓晨陽

研究發現，神經炎癥在絕大多數中樞神經系統疾病（缺血性卒中、帕金森病、阿爾茨海默病、腦白質病變等）中扮演著重要的角色[1-2]。小膠質細胞作為腦組織中常駐的免疫細胞，在炎癥發生過程中快速活化，通過其表型的變化發揮促炎和抗炎的作用[3-4]。正常生理情況下，小膠質細胞可以清除死亡的神經細胞，促進神經細胞的生長；但是小膠質細胞短期的過度活化將會引起神經炎癥，從而損傷神經細胞。小膠質細胞活化后可分為M1型和M2型兩種[5-6]。M1型為經典的活化型，它是由IFN-γ或脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導產生的[7]，主要發揮促炎作用；而M2型正好相反，它是由IL-4和IL-13誘導產生的，主要發揮抗炎作用[8]。IL-1β是M1型小膠質細胞分泌的主要炎癥因子[9]，但是其如何發揮促炎作用尚未闡明。IL-1β是一種具有多種生物活性的物質，不僅可作用于周圍神經細胞，也可作用于免疫細胞，目前尚未發現IL-1β對于小膠質細胞有何作用。因此，本研究主要探討IL-1β促進小膠質細胞M1型活化的作用和機制，為神經炎癥發生、發展的機制探索提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料 小鼠小膠質細胞BV2細胞系（武漢普諾賽生物技術有限公司，批號：CL-0493）；LPS（美國 Sigma 公司分裝）；IL-6（批號：H007）、TNF-α（批號：H052）的ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所）；一氧化氮（NO）檢測試劑盒（比色法檢測，南京建成生物工程研究所，批號：A01301）；前列腺素G2（prostaglandin，PEG2）（美國 Abcam 公司，批號：133065）；CD86的免疫熒光抗體（美國Abcam公司，批號：209896）；免疫熒光染色試劑盒（美國Sangon Biotech公司，批號：670005）；M1型標志蛋白單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）、趨化因子 8（chemokines-8，CXCL-8）的表達以及酪氨酸激酶（janus kinase 1，JAK1）、信號轉導及轉錄激活蛋白 1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）、磷酸化的JAK1（p-JAK1）、磷酸化的 STAT1（p-STAT1）的單克隆抗體（美國 CST 公司，批號：41987、10886、74129、9167、50996、14995）；JAK1抑制劑 IN-7（上海 MCE 公司，批號：126296）；重組人 IL-1β（美國 Sangon Biotech 公司，批號：600002）。

1.2 小膠質細胞的處理及分組 BV2細胞培養至對數期后，分為對照（Control）組、LPS 組、LPS+IL-1β 組。Control組常規培養；LPS組用終濃度為1 mg/L的LPS處理；LPS+IL-1β組先用15 μg/L的IL-1β預處理6 h，再用終濃度為1 mg/L的LPS處理。LPS的處理時間為24 h。IN-7處理實驗中，將BV2細胞分為LPS組、LPS+IL-1β 組、LPS+IL-1β+IN-7組，其中 LPS+IL-1β+IN-7組在IL-1β處理前6 h用0.5 μmol/L IN-7預處理，阻斷JAK1，其余處理同前。

1.3 培養基中IL-6、TNF-α、NO和 PEG2表達水平檢測 培養基中IL-6、TNF-α和PEG2表達水平檢測采用ELISA法，NO表達水平檢測采用比色法。LPS干預BV2 細胞后，在 3、6、12、18、24 h 取培養基，用酶標儀在450 nm處測定吸光度（A），以標準品的濃度為橫坐標，A為縱坐標繪制標準曲線，根據A帶入標準曲線擬合方程式，計算培養基中細胞因子水平，結果以ng/L表示。

1.4 BV2細胞中CD86熒光染色實驗 采用細胞爬片法進行細胞的免疫熒光染色。將蓋玻片置于6孔板中，接種BV2細胞后待細胞長至70%，LPS處理后，用新鮮配置的4%多聚甲醛固定細胞10 min。PBS洗3次后用0.2%的Triton X-100進行透化處理10 min，2% BSA封閉30 min，單克隆抗體1∶300稀釋后進行室溫孵育1 h，PBS洗3次后，加入IgG抗體進行標記孵育。最后用0.5 mg/L DAPI染色試劑進行細胞核染色，PBS洗2次后加封片，熒光顯微鏡下觀察，以熒光強度表示。

1.5 MCP-1、CXCL-8及JAK1-STAT1信號蛋白JAK1、STAT1、p-JAK1、p-STAT1表達水平檢測 采用Western blot法。收集細胞用PBS洗2次后加入預冷的1.0 ml RIPA裂解液，在冰上裂解30 min，10 000 g轉速下離心15 min，BCA試劑盒蛋白定量，用5×loading buffer煮沸8 min后進行電泳，PVDF膜使用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST稀釋單克隆抗體一抗，孵育后PVDF膜用TBST洗2次后，用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗孵育。孵育完成后用化學發光法檢測，采用Image Pro-Plus 6.0軟件進行光密度的分析，以GAPDH為內參，結果以目的蛋白與內參蛋白光密度值的比值表示。

1.6 統計學處理 采用SPSS 21.0統計軟件。實驗重復3次。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組培養基中IL-6、TNF-α、NO和PEG2表達水平比較 隨著時間的延長，Control組培養基中 IL-6、TNF-α、NO和PEG2表達水平并無顯著變化，且處于低水平。LPS組和LPS+IL-1β組培養基中IL-6、TNF-α、NO和PEG2表達水平隨著時間的延長均上調（均P＜0.05）；與Control組比較，LPS組和LPS+IL-1β組培養基在 3、6、12、18、24 h 時 IL-6、TNF-α、NO 和 PEG2表達水平均上調（均 P＜0.05）；與LPS組比較，LPS+IL-1β 組培養基在 3、6、12、18、24 h 時 IL-6、TNF-α、NO 和 PEG2表達水平均上調（均P＜0.05），見圖1。

圖1 各組培養基中IL-6、TNF-α、一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PEG2）表達水平比較[與Control組比較，*P＜0.05；與脂多糖（LPS）組比較，△P＜0.05]

2.2 各組細胞中CD86熒光強度比較 與Control組比較，LPS組和LPS+IL-1β組細胞中CD86熒光強度均上調（均P＜0.05）。與LPS組比較，LPS+IL-1β組細胞中CD86熒光強度上調（P＜0.05），見圖 2（插頁）。

圖2 各組細胞中CD86熒光強度比較（LPS為脂多糖）

2.3 各組細胞中MCP-1、CXCL-8及JAK1-STAT1信號蛋白表達水平比較 與Control組比較，LPS組和LPS+IL-1β 組細胞中 MCP-1、CXCL-8、JAK1、STAT1、p-JAK1、p-STAT1蛋白表達水平均上調（均P＜0.05）；與LPS組比較，LPS+IL-1β 組細胞中 MCP-1、CXCL-8、JAK1、p-JAK1、p-STAT1蛋白表達水平均上調（均P＜0.05），見圖3。

圖3 各組細胞中單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）、趨化因子8（CXCL-8）及酪氨酸激酶（JAK1）-信號轉導及轉錄激活蛋白1（STAT1）表達水平比較[p-JAK1為磷酸化的JAK1；p-STAT1為磷酸化的STAT1；與Control組比較，*P＜0.05；與脂多糖（LPS）組比較，△P＜0.05]

2.4 抑制JAK1后，各組培養基中IL-6、TNF-α、NO和PEG2表達水平比較 IN-7預處理后，與LPS組和LPS+IL-1β 組比較，LPS+IL-1β+IN-7 組培養基在 3、6、12、18、24 h 時 IL-6、TNF-α、NO 和 PEG2表達水平均下調（均 P＜0.05），見圖 4。

圖4 抑制酪氨酸激酶（JAK1）后，各組培養基中IL-6、TNF-α、一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PEG2）表達水平比較[與脂多糖（LPS）組比較，*P＜0.05；與 LPS+IL-1β 組比較，△P＜0.05]

2.5 抑制JAK1后，各組細胞中CD86熒光強度比較IN-7預處理后，與LPS組和LPS+IL-1β組比較，LPS+IL-1β+IN-7組細胞中CD86熒光強度下調（均P＜0.05），見圖 5（插頁）。

圖5 抑制酪氨酸激酶（JAK1）后，各組細胞中CD86熒光強度比較（LPS為脂多糖）

2.6 抑制JAK1后，各組細胞中MCP-1、CXCL-8及JAK1-STAT1信號蛋白表達水平比較 IN-7預處理后，與LPS組和LPS+IL-1β組比較，LPS+IL-1β+IN-7組細胞中 MCP-1、CXCL-8、JAK1、STAT1、p-JAK1、p-STAT1蛋白表達水平均下調（均P＜0.05），見圖6。

圖6 抑制酪氨酸激酶（JAK1）后，各組細胞中單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）、趨化因子8（CXCL-8）及JAK1-信號轉導及轉錄激活蛋白（STAT1）表達水平比較[p-JAK1為磷酸化的JAK1；p-STAT1為磷酸化的STAT1；與脂多糖（LPS）+IL-1β組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，△P＜0.05]

3 討論

神經炎癥是神經系統接收外界信號產生的先天性免疫應答反應，是機體防御系統啟動的標志[10]。在神經炎癥中，小膠質細胞釋放過度的炎癥因子，在疾病的發展過程中發揮著重要的作用[11]。小膠質細胞是中樞系統膠質細胞的一類，也是發揮神經炎癥的主要細胞之一。既往研究已經發現小膠質細胞是一種巨噬細胞，可以分為M0、M1、M2型[12]。M0是小膠質細胞靜止狀態，而M1和M2是激活態的小膠質細胞。M1細胞主要發揮識別、趨化和吞噬的功能，然而小膠質細胞過度的激活可以大量釋放TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子，促進神經細胞的損傷。其機制和IL受體等信號激活有關，所以M1型巨噬細胞也是促炎細胞。其中IL-1β是巨噬細胞主要釋放的促炎因子之一，有著多種病理生理功能[13]。而M2型細胞正好相反，主要起到抗炎的作用[14]，在神經炎癥的發生、發展中M1/M2的平衡和轉化是至關重要的。

既往研究發現TNF-α、IL-1β是最重要的炎癥因子，它可以誘導星型膠質細胞和內皮細胞產生趨化因子和黏附因子，進一步增強慢性炎癥的進展[15]。IL-1β對小膠質細胞具有自分泌的作用，能上調IL-6和TNF-α的表達，促進小膠質細胞的增生[15-16]，也可以誘導神經細胞的損傷和凋亡。因此，可以說IL-1β是通過小膠質細胞自分泌后影響神經細胞及周圍細胞。但是在神經炎癥中小膠質細胞的活化是級聯放大的，所以分泌的IL-1β是否通過誘導小膠質細胞活化發揮作用也尚未可知。為了探明IL-1β對于小膠質細胞活化的作用，本實驗采用LPS誘導小膠質細胞M1型活化，LPS是M1型激活的經典激活劑，可以誘導小膠質細胞向M1型激活，其中M1型標志物IL-6、TNF-α、NO和PEG2的表達水平上調，而未經過LPS刺激的對照組細胞IL-6、TNF-α、NO和PEG2的表達未見明顯變化。值得注意的是，當用IL-1β 預處理 BV2細胞后，IL-6、TNF-α、NO 和 PEG2等表達水平進一步上調，同時免疫熒光的結果也顯示CD86的表達上調，明顯高于單一LPS誘導。CD86是M1型細胞膜表面標志物，它的表達水平增高，說明了BV2向M1進行了轉化。因此，從表型轉化的角度來看，IL-1β可以輔助LPS促進小膠質細胞的M1型活化。

小膠質細胞的活化受到多條信號通路的調控，其中JAK1-STAT1是主要的調控信號。IFN-γ和LPS是誘導M1型活化的重要內源性物質，在JAK1信號中，STAT1的激活是M1活化的關鍵信號[17-19]。LPS和IFN-γ通過激活p-JAK1激活了p-STAT1，從而誘導信號的傳遞。而在本研究中也發現IL-1β可以進一步激活JAK1-STAT1的激活，表現為p-JAK1和p-STAT1的表達上調，且明顯高于單一的LPS誘導。為了明確IL-1β是否通過該信號，本實驗采用IN-7進行JAK1的阻斷，結果顯示，當JAK1阻斷后，IL-1β的作用受到了抑制，M1型標志分泌因子IL-6、TNF-α、NO和PEG2的表達水平下調，甚至低于單一LPS組，這是因為LPS通過促進JAK1信號激活發揮作用，當JAK1信號受到抑制后，LPS自然無法發揮作用。同時免疫熒光染色結果也顯示CD86的表達水平下調。其標志物MCP-1和CXCL-8的表達下調[20]，JAK1信號中關鍵因子p-STAT1的表達下調。所以該實驗證明IL-1β促進小膠質細胞M1活化是激活了JAK1-STAT1信號發揮作用的。

綜上所述，本研究發現IL-1β可以輔助小膠質細胞的M1型活化，其作用機制是通過JAK1-STAT1信號發生的。這是神經炎癥中IL-1β發揮作用的新機制，為神經炎癥的研究提供了新的思路和參考。