CO2點陣激光聯合糖皮質激素治療兔耳增生性瘢痕的療效評價

洪旭東 沈盛縣 金劍 張炳臣 范浩 張旭東 吳思捷 羅鵬飛

增生性瘢痕（hypertrophic scar，HS）是一種皮膚纖維增生性疾病，常發生于嚴重創傷、深度燒傷和外科手術切口等創面愈合過程中[1]。創傷后組織細胞過度增生、細胞外基質過度表達并沉積在局部造成局部結構紊亂是HS具有破壞性的特征[2-3]。長期反復的炎性刺激是導致瘢痕呈增生性生長的最重要致病因素[4]。除此之外，HS的發病機制與感染、傷口內異物、過度的傷口張力或傷口邊緣的持續牽拉活動等也密切相關[5]。糖皮質激素是治療HS的一線藥物之一，給藥途徑為瘢痕內注射，給藥頻次通常為每月注射1次，屬于有創操作，存在注射時不適和疼痛明顯、注射阻力極大、醫患雙方體驗感均差以及瘢痕內藥物分布不均勻等問題，因此部分學者將其作為HS的二線治療藥物[6]。盡管早期干預性治療是防治HS的第一步，但糖皮質激素的使用會降低患者免疫力，增加創面感染及延遲愈合的風險，因此，臨床中應盡量減少糖皮質激素的用量。研究發現糖皮質激素與其他治療方法聯合應用可提高HS的治療效果，包括聯合使用5-氟尿嘧啶（5-FU）、維拉帕米等[7]。近年來激光在HS防治中的作用越來越受到重視和認可[8]，其中點陣激光自2003年首次報道以來被越來越多地用于HS防治（能量和范圍根據HS實際情況確定，頻次為每月1次）[9]。相較于常規有創治療，點陣激光具有精準和微創兩大優勢，理論上將點陣激光和藥物注射聯合應用，不僅可以降低損傷程度和疼痛不適感，還可以解決藥物分布不均勻等問題，有可能使治療效果倍增。因此，本研究通過建立兔耳HS模型，采用CO2點陣激光聯合糖皮質激素（曲安奈德）防治HS，以期為臨床兩者聯合應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 成年雄性新西蘭大白兔15只，體重2.5～3.0 kg，由海軍軍醫大學動物實驗中心購得并飼養。將大白兔置于特定的SPF級別環境中，控制室溫23～27℃、相對濕度45%～65%、12 h光照/暗循環。所有動物實驗程序均符合美國國立衛生研究院出版的《護理和使用實驗動物指南》（出版號：96-01）。

1.2 主要儀器及試劑 CO2點陣激光治療儀（型號：UltraPulse Encore，以色列Lumenis科醫人醫療激光公司）；皮膚活檢器（中國精工儀表儀器廠，直徑：8 mm）；顯微鏡及其配套拍照測量軟件（型號：DMI3000B LAS AF系統，德國Leica公司）；凝膠成像系統及其配套拍照測量軟件（型號：ImageQuant LAS 4000系統，美國GE Healthcare公司）；曲安奈德注射液（昆明積大制藥股份有限公司，8 mg/ml）；平滑肌肌動蛋白（smooth muscle actin，SMA）抗體（英國 Abcam 公司，批號：ab240654）；Ⅰ型膠原蛋白（Collagen Ⅰ）抗體（美國 Thermo Fisher Scientific公司，批號：MA1-26771）；β-actin抗體（英國Abcam 公司，批號：ab8227）。

1.3 兔耳HS模型建立和治療方法 兔耳HS模型建立方法：兔耳緣靜脈注射1%戊巴比妥鈉（3 ml/kg），手術部位局部注射2%利多卡因和1∶20萬稀釋的腎上腺素。用皮膚活檢器在每只耳的腹側表面各打6個直徑8 mm、間隔10 mm以上的圓形創面，再用手術刀片切除表皮、真皮和軟骨膜，在軟骨上用手術刀反復刮擦，徹底去除軟骨膜（圖1），用棉球加壓止血；造模第14天左右，創面痂皮自然脫落，形成HS。采用隨機數字表法將大白兔分為對照組、激素組和激光激素組3組，每組5只共10只耳朵，每只耳朵制備6個瘢痕創面，每組共60個瘢痕創面。造模第14天，對照組用0.9%氯化鈉溶液涂抹創面；激素組用胰島素注射器（29G針頭：0.33 mm×12.7 mm）在HS內注射8 mg曲安奈德注射液（每點2 mg，共4個點位）；激光激素組給予激光治療（參數設置如下：body模式，能量 80 mJ，范圍 1 cm×1 cm，密度 11.1%），繼而在創面涂抹8 mg曲安奈德注射液。造模后第14、21、28、35天，分別行HS大體形態觀察，擴大切取HS組織（每只大白兔每個時間點取3處，每組共計取15處，切取范圍擴大至HS組織周邊1～2 mm寬度的正常組織）行病理檢查并測定瘢痕增生指數（hypertrophic index，HI）；造模后第35天檢測HS組織中Collagen Ⅰ和SMA蛋白表達水平。

圖1 兔耳增生性瘢痕（HS）模型建立（a：皮膚活檢器，直徑為8 mm；b：在兔耳腹側用直徑為8 mm的皮膚活檢器建立兔耳HS模型，各創面之間距離＞10 mm）

1.4 病理檢查 HS組織固定于4%多聚甲醛24 h，經脫水、浸蠟、石蠟包埋后，自HS組織中間部位（瘢痕增生最顯著部位）開始向兩端作連續切片（5 μm）并置于載玻片上，脫蠟后行HE染色，觀察HS形成狀況。

1.5 HI測定 將造模后第14、21、28、35天的HS組織切片置于DMI3000B顯微鏡低倍鏡下進行拍照，并通過LAS AF軟件分別測量HS厚度A和正常皮膚厚度B（具體測量方法見圖2）。計算不同時間點各組HI，HI計算公式[10]如下：HI=（HS厚度A-正常皮膚厚度B）/正常皮膚厚度B。

圖2 HE染色后在顯微鏡下觀察利用LAS AF軟件測量瘢痕增生指數（HI）（HS為增生性瘢痕）

1.5 Collagen Ⅰ和SMA表達水平檢測 采用Western blot法。HS組織研磨后加入組織裂解液冰上裂解10 min，4℃12 000 r/min離心10 min，取上清液作為HS組織蛋白提取液，SDS-PAGE凝膠電泳（分離膠8%，濃縮膠5%）分離蛋白并轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別加入一抗（SMA抗體1∶1 000稀釋，Collagen Ⅰ抗體 1∶2 000稀釋，β-actin抗體 1∶2 000稀釋）4 ℃孵育過夜；加入對應二抗，室溫孵育1 h。凝膠成像分析系統對結果拍照并用自帶軟件進行灰度值分析，目的蛋白灰度值與內參蛋白（β-actin）灰度值的比值即為目的蛋白相對表達量。

1.6 統計學處理 采用SPSS 21.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模后不同時間點各組兔耳HS大體形態比較 對照組兔耳創面在造模后第14天脫痂時開始出現瘢痕增生，造模后第21、28和35天時瘢痕繼續增生，而激素組和激光激素組兔耳瘢痕增生速度明顯慢于對照組。造模后第35天，對照組兔耳創面肉眼可見明顯高于周圍正常皮膚的HS組織，與周圍正常皮膚比較，顏色明顯更深、色澤更暗、質地更硬；激素組和激光激素組兔耳創面均未見明顯高于周圍正常皮膚的HS組織，但激素組兔耳HS組織顏色更深、質地偏硬，而激光激素組兔耳HS組織顏色和質地均與周圍正常皮膚無明顯差別，顯示出對HS最佳的抑制效果（圖3，見插頁）。

圖3 造模后不同時間點各組兔耳創面增生性瘢痕（HS）大體形態比較

2.2 各組兔耳HS組織病理檢查結果比較 造模后第35天，對照組兔耳HS組織中成纖維細胞數目增多明顯，微血管密集，炎性細胞浸潤明顯，纖維組織排列紊亂，無規律；而激素組和激光激素組兔耳HS組織中成纖維細胞數目明顯減少，微血管密度也較對照組減少，炎性細胞浸潤較輕，纖維組織相對規律，成線條狀排列；較激素組而言，激光激素組兔耳HS組織中成纖維細胞數目和微血管密度更少，炎性細胞浸潤更輕（圖4，見插頁）。

圖4 造模后第35天各組兔耳增生性瘢痕（HS）組織病理檢查結果比較（a：對照組；b：激素組；c：激光激素組；HE染色，×20）

2.3 造模后不同時間點各組兔耳HS組織HI比較 造模后第14天各組兔耳HS組織HI比較差異無統計學意義（P＞0.05）；造模后第 21、28、35 天，激光激素組和激素組HS組織HI均低于對照組（均P＜0.05）；造模后第28天，激光激素組HS組織HI低于激素組（P＜0.05），見表 1。

表1 造模后不同時間點各組兔耳HS組織HI比較

2.4 各組兔耳HS組織中Collagen Ⅰ和SMA表達水平比較 激光激素組和激素組兔耳HS組織中Collagen Ⅰ和SMA表達水平均低于對照組（均P＜0.05）；激光激素組兔耳HS組織中SMA表達水平低于激素組（P＜0.05），而兩組兔耳HS組織中Collagen Ⅰ表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖5。

圖5 各組兔耳增生性瘢痕（HS）組織中Ⅰ型膠原蛋白（Collagen Ⅰ）和平滑肌肌動蛋白（SMA）表達水平比較（a：各組兔耳HS組織中Collagen Ⅰ和SMA蛋白表達的電泳圖；b：各組兔耳HS組織中Collagen Ⅰ表達水平比較，與對照組比較，*P＜0.05；c：各組兔耳HS組織中SMA表達水平比較，與對照組比較，*P＜0.05；與激素組比較，△P＜0.05）

3 討論

近年來，越來越多的研究發現，在創面愈合后、HS尚未明顯成形的早期便開始激光干預，可以有效預防HS的形成，減緩其發生、發展進程，具體表現為瘢痕體積縮小、瘙癢感改善、增生期時間窗縮短等[11]。研究還證實，在多種激光技術中，早期應用非剝脫性點陣鉺激光[12]、脈沖染料激光[13]和磷酸鉀鈦激光[14]均可以有效地預防手術和創傷后HS的形成。除了預防作用外，CO2點陣激光還可有效治療創傷和手術后已經形成的HS[15-16]。

糖皮質激素常作為治療HS和瘢痕疙瘩的瘢痕內注射的首選藥物[17-18]，其作用機制包括：抑制成纖維細胞增生和膠原合成、促進成纖維細胞凋亡和局部組織重塑等，從而達到軟化硬度、降低高度、縮小體積、促進成熟的治療效果。本實驗研究結果也證實，單獨糖皮質激素處理創傷后早期兔耳HS，可以有效抑制HS形成（造模局部僅有顏色更深、質地更硬的的HS，未見明顯高于周圍正常皮膚），減少Collagen Ⅰ和SMA的表達，具有一定防治瘢痕過度增生的作用。

研究發現，CO2點陣激光可以和防治HS的多種措施聯用，兩者發揮協同效應，使治療效果倍增。具體包括：CO2點陣激光與5-FU聯合使用，其熱分解作用有助于穿透HS組織的形成微細孔道，從而提高5-FU的通透性和彌散率[19]；CO2點陣激光與富血小板血漿組織聯合治療還能顯著改善痤瘡瘢痕組織的外觀和皮膚紋理[20]。本研究利用CO2點陣激光作用于組織后能夠穿透HS組織的形成微細孔道的機制，聯合外用糖皮質激素達到類似注射糖皮質激素治療的目的，能有效解決藥物分布不均、注射阻力大、疼痛不適感強等傳統瘢痕內注射遇到的難題。

本實驗研究結果顯示：經過CO2點陣激光與糖皮質激素的聯合處理后，激光激素組創面未見明顯高于周圍正常皮膚的HS，顏色和質地與周圍正常皮膚也均無明顯差別；而激素組創面盡管未見明顯高出正常皮膚的HS，但局部顏色偏深、質地偏硬，說明CO2點陣激光與糖皮質激素聯合應用抑制HS的總體效果最佳。此外，造模后第28天激光激素組HI明顯低于激素組，進一步說明兩者聯合應用的療效優于單用糖皮質激素，可以在更短的時間內形成對HS的抑制效應。本實驗中，激素組部分愈合創面因注射藥物不均勻、局部壓力過大造成局部組織缺血甚至尖端組織壞死脫落形成局部缺損，而激光激素組并未發現該現象，這提示CO2點陣激光治療可以在一定程度上避免HS內注射遇到的上述難題。

綜上所述，本動物實驗提示，CO2點陣激光聯合糖皮質激素治療可以有效防治HS，為臨床應用提供了依據。