p65和p16在局限期小細胞肺癌中的表達及其臨床意義

黃魯眾 蔣中秀 趙志光

小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）約占肺癌的13%～15%，確診時只有不足1/5屬于局限期，大部分已錯過手術時機[1-2]。SCLC患者雖然對放化療較敏感，但總體生存期仍較短。近年來，隨著靶向治療和免疫治療的出現，SCLC患者的生存期得到明顯延長[3-4]。但SCLC的治療水平并未取得突破性進展，對其發生、發展機制等尚不明確，有關其復發、預后評估的有效指標也較少。本研究應用免疫組化SP法檢測128例局限期SCLC患者的癌組織和其中50例患者的癌旁肺組織中p65、p16的表達情況，并進行相關性分析和預后分析，以探討p65和p16在局限期SCLC中的臨床意義。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2010年1月至2018年12月在溫州醫科大學附屬第二醫院經病理確診的128例局限期SCLC患者的癌組織標本，患者中男87例，女41例；年齡 33～74（56.60±11.08）歲，其中≤40歲 16例，＞40歲～≤60歲87例，＞60歲25例；腫瘤部位：左側64例，右側64例；腫瘤最大徑：≤3 cm 27例，＞3.0 cm～≤7.0 cm 90例，＞7.0 cm 11例；淋巴結有轉移72例，無轉移56例；術前血清神經元特異性烯醇化酶（neuronspecific enolase，NSE）水平升高77例，正常51例。并將其中50例患者的癌旁肺組織作為對照。納入標準：（1）有明確的病理診斷；（2）局限期指病變局限于一側胸腔且能被納入一個放射治療野，經胸部CT、腹部CT、腦MRI等確定；（3）患者行根治性手術，術前未行抗腫瘤治療，術后予化放療等輔助治療；（4）臨床資料完整。排除標準：（1）除外混合腺癌、鱗癌等其他惡性成分的患者；（2）排除隨訪時間不足6個月失訪的患者。本研究經溫州醫科大學附屬第二醫院醫學倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意。

1.2 SCLC癌組織與癌旁肺組織中p65、p16表達檢測 采用免疫組化SP法。標本經固定、脫水、透明、包埋等制成石蠟切片，切片厚度為4 μm。脫蠟水化，滴加3% H2O2，室溫孵育1 h，滴加檸檬酸液加熱修復8 min后冷卻至室溫，滴加非免疫血清封閉3.5 h；滴加p65、p16抗體（分別按 1∶500、1∶200稀釋）后 4 °C 冰箱過夜；滴加二抗室溫孵育1 h，滴加辣根酶標記鏈卵白素液室溫孵育1 h，滴加DAB試劑顯色，放入蘇木素復染，脫水透明封片。

1.3 免疫組化結果判定 p65陽性定位于細胞核，細胞質染色視為陰性；p16陽性定位于細胞核或細胞質。由2位病理科醫生雙盲閱片，隨機選取5個包含癌組織的高倍視野，得出：（1）陽性細胞百分比：0%～10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分；（2）染色強度：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分?？偡?陽性細胞百分比評分×染色強度評分，總分＜3分為陰性，總分≥3分為陽性。

1.4 臨床資料收集 主要包括患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑、淋巴結轉移和術前血清NSE水平等。采用住院（門診）觀察、電話聯系等形式隨訪，隨訪截止時間為2020年12月。

1.5 統計學處理 采用SPSS 21.0統計軟件。計數資料組間比較采用x2檢驗；SCLC癌組織中p65與p16表達的相關性分析采用Pearson相關；預后分析應用Kaplan-Meier曲線，生存率比較應用log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SCLC癌組織與癌旁肺組織中p65、p16表達的比較 SCLC癌組織中p65陽性表達率為56.3%（72/128），明顯高于癌旁肺組織的8.0%（4/50），差異有統計學意義（x2=34.212，P＜0.01）；SCLC癌組織中p16陽性表達率為35.2%（45/128），明顯低于癌旁肺組織的70.0%（35/50），差異有統計學意義（x2=17.641，P＜0.01）。免疫組化結果見圖1。

圖1 小細胞肺癌（SCLC）癌組織與癌旁肺組織中p65、p16的表達（a：SCLC癌組織中p65表達呈陽性；b：癌旁肺組織中p65表達呈陰性；c：SCLC癌組織中p16表達呈陰性；d：癌旁肺組織中p16表達呈陽性；免疫組化SP法，×200）

2.2 SCLC癌組織中p65與p16表達的相關性 Pearson相關分析顯示SCLC癌組織中p65與p16表達呈負相關（r=-0.406，P＜0.01），見表 1。

表1 SCLC癌組織中p65與p16表達的相關性（例）

2.3 SCLC癌組織中p65、p16陽性表達與臨床特征的關系 SCLC癌組織中p65陽性表達與淋巴結轉移和術前血清NSE水平均有關（均P＜0.05），而與患者性別、年齡、腫瘤部位和腫瘤最大徑均無關（均P＞0.05）。SCLC癌組織中p16陽性表達與淋巴結轉移有關（P＜0.05），而與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑和術前血清NSE水平均無關（均P＞0.05），見表2。

表2 SCLC癌組織中p65、p16陽性表達與臨床特征的關系（例）

2.4 SCLC癌組織中p65、p16陽性表達與預后的關系 128例SCLC患者中有9例失訪，最終納入119例患者進行預后分析。隨訪截止時，死亡107例，存活12例?；颊呖傮w中位生存期為20.3個月，1年和2年生存率分別為85.6%和37.6%，見圖2a。p65陽性表達患者的總體中位生存期為18.9個月，明顯短于p65陰性表達患者的 21.8個月，差異有統計學意義（x2=7.695，P=0.006），見圖2b。p16陽性和陰性表達患者的總體中位生存期分別為21.3和19.8個月，兩者比較差異無統計學意義（x2=3.228，P=0.072），見圖 2c。

圖2 小細胞肺癌（SCLC）癌組織中p65、p16陽性表達與預后的關系（a：SCLC患者總體生存期；b：p65的表達水平與SCLC患者預后的關系；c：p16的表達水平與SCLC患者預后的關系）

3 討論

SCLC惡性程度高，較早發生淋巴結轉移和遠處轉移，中位生存期短。近30多年來，其治療水平基本處于平臺期，初診時的分期、規范的治療是治療的關鍵[5-6]。對于可行手術的局限期SCLC患者，術后化療或同步化放療可以控制腫瘤的生長，但其無進展生存期和總體生存期仍較短[1]。

本研究顯示，SCLC患者p65表達上調，p16表達下調，可能在腫瘤的發生、發展過程中發揮一定的作用。同時，SCLC癌組織中p65與p16表達呈負相關，提示兩者相關的通路可能存在一定的關聯。p65是NF-κB家族中含量最豐富、功能最重要的成員。其作用于腫瘤的機制主要包括：（1）激活細胞周期蛋白 D1（CycinD1），促進細胞無限生長[7-8]；（2）參與血管生成以及腫瘤微環境的形成，為腫瘤生長提供能量；（3）產生氧自由基造成DNA損傷[8]等。p16基因是最早發現的直接參與調控細胞周期的腫瘤抑制基因[9-10]，其表達產物p16INK4A與CDK4/6特異性結合，阻礙其與CycinD1形成復合物，以致細胞停留在G1期，無法進入S期[10-11]。當p16基因突變或失活時，細胞周期失去調控，導致細胞無限生長。

SCLC分期大多應用美國退伍軍人醫院研究小組制定的標準，TNM分期一般用于術前疾病評估[12]。局限期SCLC的術前TNM分期主要與腫瘤最大徑和淋巴結轉移有關。腫瘤最大徑與腫瘤的增殖水平有關。隨著醫療水平的進步以及患者對肺癌的認知水平和重視水平的提高，大多數患者會定期體檢，所以就診時，腫瘤體積不會過大。淋巴結轉移與腫瘤的遷移水平有關。本研究得出在淋巴結轉移的SCLC患者中，p65上調，p16下調。p65基因可直接作用于瘤細胞惡性表型相關基因，以及激活Snail轉錄因子，從而誘導上皮-間質轉化，以獲得更強的遷移能力[13]；而p16基因失活，可上調基質細胞衍生因子（SDF-1）和基質金屬蛋白酶2（MMP-2）的表達[14]，同樣可以促進上皮-間質轉化。血清NSE是臨床檢測SCLC的首選腫瘤標志物，可用于疾病的進展與預后評估[15-16]。本研究中，p65的表達水平與術前血清NSE水平有關，提示p65基因的激活，可能促進神經內分泌細胞分泌NSE。

國內外關于p65與SCLC患者的預后研究不多，更多的預后研究是關于非小細胞肺癌。Lin等[17]研究顯示，p65和p-p105共同陽性表達與非小細胞肺癌的預后不良有關，而p65的單獨陽性表達與其無明顯相關性。郭子君等[18]的一項關于SCLC的研究，得出p65陰性表達患者預后更好，與本研究結果一致。國內外關于p16與SCLC的研究主要是表達水平的變化，而有關預后生存的研究暫無報道。p16缺失突變包括純合缺失和雜合缺失，在雜合缺失突變中是可以正常表達p16蛋白[14]，因此在蛋白水平研究p16基因突變與預后關系不如基因水平研究更嚴謹。

綜上所述，p65、p16可能在SCLC患者的發生和發展中起一定作用；同時，p65也可能對SCLC患者的預后有一定的指導意義。