青藤堿對異煙肼和利福平聯用致小鼠肝損傷的保護作用

於鵬飛 柴佳園 李俊峰 王康 劉文洪

結核病作為由結核分枝桿菌感染導致的傳染性疾病，對人類的生命健康造成了巨大威脅[1]，目前中國結核病防治形勢同樣嚴峻[2]。異煙肼和利福平是治療結核病的一線藥物，兩者聯用效果更佳，但兩者聯用會導致肝損傷[3-4]。因此，急需尋求一種藥物在治療肺結核的同時能有效降低異煙阱和利福平一線抗結核藥物導致的肝損傷。青藤堿提取自中藥青藤，具有鎮痛、鎮靜、免疫抗炎等功能。研究表明，青藤堿能對人體肝臟星狀細胞的增殖和凋亡產生調控作用[5]，能夠治療刀豆蛋白A（concanavalin A，Con A）導致的免疫性肝損傷[6]等。本研究探討青藤堿對異煙肼和利福平聯用致小鼠肝臟損傷的保護作用，從而為開發和尋找保護肝損傷藥物提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 3～8周雄性清潔級ICR小鼠60只，體重18～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物許可證號：SYXK（浙江）2015-0009，由浙江中醫藥大學動物實驗研究中心喂養。動物房環境：溫度（23±3）℃，濕度50%～70%，12 h晝夜循環。小鼠自由飲水及進食。

1.2 藥品、試劑與儀器 青藤堿 [CAS號：115-53-7，純度：高效液相色譜（HPLC）≥98%，批號：Dasf200329]購自南京道斯夫生物科技有限公司；異煙肼（規格：100 mg，批號：T20C081）購自杭州民生藥業有限公司；利福平（規格：0.15 g，批號：1908021）購自沈陽紅旗制藥有限公司；聯苯雙酯（規格：1.5 mg，批號：A02J191005）購自萬邦德制藥集團股份有限公司；AST試劑盒（批號：20200713）、ALT 試劑盒（批號：20200712）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號：20200715）、TG 試劑盒（批：20200712）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒（批號：20200710）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號：20200713）、考馬斯藍蛋白試劑盒（批號：20200712）均購自南京建成生物工程研究所；高速離心機（型號：FC5718）購自上海安亭儀器有限公司；電子天平（型號：JA2003N）購自上海菁華科技儀器有限公司；光學顯微鏡（型號：DM300）、石蠟切片機（型號：RM2265）均購自德國徠卡公司。

1.3 分組造模和給藥 采用隨機數字表法將60只小鼠分為正常對照組、模型組、青藤堿低劑量組、青藤堿中劑量組、青藤堿高劑量組和聯苯雙酯組6組，每組10只。除正常對照組外，其余各組給予異煙肼（100 mg/kg，溶于20 ml 0.9%氯化鈉注射液）和利福平（100 mg/kg，溶于20 ml 0.9%氯化鈉注射液）灌胃建立肝損傷小鼠病理模型[7]；正常對照組給予20 ml 0.9%氯化鈉注射液灌胃。造模2 h后，正常對照組和模型組分別給予蒸餾水（20 ml/kg）灌胃，青藤堿低、中、高劑量組分別給予青藤堿 50、100、150 mg/kg（均溶于 4 ml蒸餾水）灌胃，聯苯雙酯組給予聯苯雙酯（200 mg/kg，溶于4 ml蒸餾水）灌胃，各組均連續給藥，1次/d，連續10 d。

1.4 檢測材料收集與處理 所有動物末次灌胃后禁水禁食24 h，稱體質量。壓迫小鼠頸部兩側，使眶后靜脈叢充血，持玻璃毛細血管從小鼠左側內眥部刺入取血。脊椎脫臼法處死，開腹、取肝臟，清洗干凈、擦干、稱肝質量。肝臟指數=肝質量（mg）/體質量（g）。切大約 0.5 g肝右葉制備肝勻漿，在0.9%氯化鈉溶液中漂洗干凈，剝除表面附著的結締組織并用濾紙拭干，用移液管量取9倍于肝臟體積的0.9%氯化鈉溶液預冷，在冰水浴中用眼科小剪盡快剪碎組織塊并利用組織勻漿機勻漿，3 000 rpm離心10 min，取上清液，待測。

1.5 生化指標檢測 采用比色法測定血清ALT、AST、TG水平以及肝勻漿中MDA含量、SOD活性及GSH含量。嚴格遵照產品說明書進行測定。

1.6 肝組織形態學變化觀察 從肝左外葉中取材，10%甲醛固定后，經梯度乙醇脫水，二甲苯處理后，常規石蠟包埋、切片、HE染色，光學顯微鏡觀察肝組織形態學變化。

1.7 統計學處理 采用SPSS 25.0統計軟件。正態分布的計量資料以表示，方差齊時，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；方差不齊時，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗。偏態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠肝臟指數比較 與模型組比較，青藤堿中、高劑量組和聯苯雙酯組肝臟指數均下降（均P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠肝臟指數比較

2.2 各組小鼠血清ALT、AST、TG水平比較 與正常對照組比較，模型組小鼠血清ALT和AST水平均升高（均P＜0.01）。與模型組比較，青藤堿高劑量組和聯苯雙酯組小鼠血清 ALT、AST、TG 水平均降低（均 P＜0.05），青藤堿中劑量組小鼠血清AST、TG水平均降低（均P＜0.05），見表 2。

表2 各組小鼠血清ALT、AST、TG水平比較

2.3 各組小鼠肝勻漿SOD活性及GSH、MDA水平比較與正常對照組比較，模型組小鼠肝勻漿中SOD水平降低（P＜0.01）。與模型組比較，青藤堿高劑量組小鼠肝勻漿中SOD活性升高（P＜0.01）；青藤堿中、高劑量組小鼠肝勻漿中GSH水平均升高（均P＜0.01）；青藤堿低、中、高各劑量組小鼠肝勻漿中MDA水平均降低（均P＜0.01），見表 3。

表3 各組小鼠肝勻漿SOD活性及GSH、MDA水平比較

2.4 各組小鼠肝臟組織形態學變化比較 肉眼觀察：正常對照組小鼠肝顏色為紅褐色，大小形態正常，質地柔軟、光滑；模型組小鼠肝損傷體積變大，色澤暗黃，肝緣圓鈍；青藤堿各劑量組和聯苯雙酯組小鼠肝有輕微的水腫表現，質地柔軟，色澤紅褐。光鏡下觀察：正常對照組小鼠肝細胞形態正常，肝索排列規則，肝小葉結構完整，界限清晰，以中央靜脈為中心，肝臟細胞排列呈放射狀，肝細胞核大且圓，分布均勻；模型組小鼠肝組織損傷嚴重，肝索排列紊亂，肝小葉結構不清，界限模糊，肝組織炎性細胞浸潤；青藤堿各劑量組肝小葉結構接近正常，肝細胞排列較為整齊，炎性細胞浸潤減少，肝損傷程度隨著青藤堿劑量的增加而減輕，較模型組有所改善；聯苯雙酯組小鼠可見肝細胞輕度破壞，較模型組肝小葉結構和細胞形態得到改善，炎癥細胞量有所下降（圖1，見插頁）。

圖1 各組小鼠肝臟組織形態學觀察所見（a：正常對照組；b：模型組；c：聯苯雙酯組；d：青藤堿低劑量組；e：青藤堿中劑量組；f：青藤堿高劑量組；HE染色，×200）

3 討論

近年來關于青藤堿的研究表明其在肝損傷領域具有一定的治療效果。朱昱豪等[8]研究發現青藤堿能夠減弱Con A導致的免疫性肝損傷，減輕肝臟受損狀況并且降低血清中ALT、AST水平。郭華等[9]研究發現青藤堿能減輕氧化應激反應并且對炎癥反應具有療效。尹曉剛等[10]研究發現青藤堿具有抑制大鼠過氧化物和抗脂質過氧化的作用。因此，本實驗選擇青藤堿作為一種可能的肝損傷治療藥物進行研究。

長期大量使用異煙肼和利福平治療結核病會導致嚴重的藥物不良反應，尤其會引起使用者藥物性肝臟損傷[11-12]。韓悅等[13]利用HE染色研究異煙肼與利福平聯用之后肝組織形態，發現藥物性肝損傷后肝細胞病變顯著，隨著抗損傷藥物使用劑量的增加，這種損傷明顯減輕，同時肝臟指數也得到改善。本研究顯示，模型組小鼠肝組織中有大量炎性細胞，隨著青藤堿劑量的增加，肝臟細胞的病變逐漸減輕，炎癥反應得到緩解，同時青藤堿能夠使小鼠肝臟指數下降。王翠榮等[14]研究發現異煙肼與利福平聯用會導致肝臟損傷小鼠上層血清液中ALT、AST水平升高，而ALT與AST是檢驗肝臟組織損害常用的指標。本研究結果顯示，模型組小鼠ALT及AST水平較高，青藤堿給藥后ALT及AST水平降低，同時隨劑量增加而降低。王翠榮等[14]研究還發現肝受損小鼠肝臟勻漿SOD與谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平降低，MDA水平升高。金華等[15]研究發現肝臟急性受損小鼠可能與其體內氧自由基作用和肝組織細胞膜脂質過度氧化反應被抑制有關。MDA水平可以提示肝細胞脂質過度氧化度，GSH與氧自由基清除有關。本研究結果顯示，青藤堿給藥后肝勻漿中SOD活性與GSH水平升高，MDA水平降低，可能與青藤堿能夠使氧自由基減少與抑制脂質過氧化有關。

綜上所述，青藤堿能夠保護異煙肼和利福平聯用而導致的小鼠肝損傷，但青藤堿對慢性藥物性肝炎的具體作用機制仍需進一步研究。