不同固定方法制作細(xì)胞蠟塊的效果比較

吳杉杉 王俏洋 江佳星

脫落細(xì)胞學(xué)檢查憑借著取材方法快速、簡單、創(chuàng)傷小等優(yōu)勢已經(jīng)成為病理檢查的常規(guī)方法之一，但傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)涂片常常因為細(xì)胞量不足、細(xì)胞易出現(xiàn)退變及結(jié)構(gòu)不清等原因，導(dǎo)致細(xì)胞學(xué)診斷的困難[1-3]。目前薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查雖然改善了傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)的制片質(zhì)量，但此檢查方法處理的細(xì)胞樣本不易獲得細(xì)胞排列方式和背景對照細(xì)胞，導(dǎo)致難以鑒別可疑和高分化癌細(xì)胞以及反應(yīng)性間皮細(xì)胞和間皮瘤[4-6]。隨著分子病理檢測技術(shù)、免疫組化抗體檢測技術(shù)的廣泛應(yīng)用，體腔積液樣本可以提供更多的有效信息[3，7]，但不管是常規(guī)涂片還是液基制片，均不能進(jìn)行后續(xù)的免疫組化及分子檢測，而細(xì)胞蠟塊可以明確積液中細(xì)胞成分的分化來源以及性質(zhì)，也可以為后續(xù)相關(guān)檢測提供源源不斷的樣本數(shù)量，為靶向治療提供可靠的依據(jù)。本研究采用3種不同的固定方法，對同一漿膜腔積液提供的細(xì)胞蠟塊進(jìn)行制作，以尋求最佳固定方法，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2020年1至4月浙江省臺州醫(yī)院病理科送檢的胸腹水標(biāo)本60例，其中胸水標(biāo)本32例，腹水標(biāo)本28例；男37例，女23例；年齡 32～89（62.60±11.84）歲。

1.2 試劑 10%中性緩沖甲醛購自寧波同盛生物科技有限公司；薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查指定保存液購自美國BD公司；細(xì)胞蠟塊制作試劑盒購自廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司。按需要選擇細(xì)胞角蛋白（CK，克隆號：AE1/AE3）、CK7（克隆號：OV-TL12/30）、CK20（克隆號：Ks20.8）、微管素（Villin，克隆號：CWWB1）、癌胚抗原（CEA，克隆號：CoL-1）、尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子 2（Cdx-2，克隆號：EPR2764Y）、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子（TTF-1，克隆號：SPT24）、鈣結(jié)合蛋白（CR，克隆號：MX027）等抗體，一抗試劑購自福州邁新公司，二抗以及DAB顯色系統(tǒng)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞蠟塊制作法 （1）臨床送檢的新鮮體液標(biāo)本，量為200～500 ml。將其于陰涼處或4℃冰箱內(nèi)靜置10 min，然后將上1/3的上清液倒入廢液桶，將剩余體液倒入標(biāo)記好1、2、3的3個50ml尖底離心管，各約50 ml，2 500 r/min離心10 min，然后將上清液倒入廢液桶。若標(biāo)本細(xì)胞量過少，無需靜置后倒去上清液，直接采用多次離心（2 500 r/min）輕輕吸棄上清液的方法，富集細(xì)胞后保留沉淀。若標(biāo)本為血性標(biāo)本，將標(biāo)本倒入離心管內(nèi)首次離心，2 500 r/min離心10 min，緩慢傾倒上清液，再加適量冰醋酸乙醇溶液（95%乙醇95 ml+冰醋酸5 ml）于離心管內(nèi)，充分振蕩混勻，以混合液為淺紅色為佳，再次離心（2 500 r/min）10 min，緩慢傾倒上清液。繼而對每管進(jìn)行相應(yīng)的制作處理。（2）1號離心管中加入10%中性緩沖甲醛10 ml，振蕩，于陰涼處或4℃冰箱內(nèi)靜置2 h后2 500 r/min離心10 min，緩慢傾倒上清液，再加入95%乙醇5 ml后振蕩，于陰涼處或4℃冰箱內(nèi)靜置1 h后2 500 r/min離心10 min。2號離心管中加入薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查指定保存液10 ml，充分振蕩，于陰涼處或4℃冰箱內(nèi)靜置2 h后2 500 r/min離心10 min，緩慢傾倒上清液。3號離心管中滴加細(xì)胞蠟塊制作試劑盒的試劑A 1～3滴，充分振蕩混勻，2 500 r/min離心10 min，若上清液較多，吸棄多余的上清液，然后滴加試劑B 2～3滴，輕輕晃動離心管，靜置30 s。（3）用軟吸管將離心管底部的沉淀物吸出，置于包埋紙上，包好，放入包埋盒中，放入自動脫水機(jī)中與常規(guī)組織一起進(jìn)行脫水。待處理結(jié)束后，取出組織塊，打開包埋紙，用鑷子將細(xì)胞塊輕輕夾到包埋模具中間，行常規(guī)石蠟包埋，盡量使細(xì)胞都平鋪在模具底部，制成細(xì)胞蠟塊。

1.3.2 切片與烤片 將細(xì)胞富集蠟塊放入-28℃冰箱冷凍室中，持續(xù)冷藏放置10 min后進(jìn)行常規(guī)切片，注意常規(guī)粗修時不要過度修片，切片厚度為3 μm，均切數(shù)張備用，置入80℃烤箱烤片15 min。

1.3.3 常規(guī)HE和免疫組化染色 二甲苯脫蠟，梯度乙醇至水化后，一張切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，其余切片根據(jù)需要不同而選擇不同的抗體進(jìn)行免疫組化染色。按照一抗及二抗試劑要求，進(jìn)行PowerVision二步染色法。經(jīng)過抗原熱修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、一抗37℃孵育、二抗孵育、DAB顯色等步驟后行蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，櫻花薄膜膠帶封片，顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果 采用10%中性緩沖甲醛與95%乙醇固定的富集細(xì)胞塊，HE染色鮮艷，細(xì)胞輪廓清晰，細(xì)胞排列清楚可見，腫瘤細(xì)胞的核仁比較明顯，并且腫瘤細(xì)胞與周圍正常的間皮細(xì)胞對比明顯，背景干凈（圖1a）；薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查指定保存液固定的細(xì)胞塊HE染色偏紅，細(xì)胞排列方式基本可見，細(xì)胞核保存欠佳，部分核有固縮現(xiàn)象（圖1b）；細(xì)胞蠟塊制作試劑盒固定的細(xì)胞塊細(xì)胞量偏少，HE染色細(xì)胞輪廓較模糊，細(xì)胞核有重疊現(xiàn)象（圖1c）。

圖1 HE染色所見（a：10%中性緩沖甲醛和95%乙醇聯(lián)合固定；b：薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查指定保存液固定；c：細(xì)胞蠟塊制作試劑盒固定；×400）

2.2 免疫組化標(biāo)記結(jié)果 實驗得出10%中性緩沖甲醛和95%乙醇聯(lián)合固定的細(xì)胞富集蠟塊的免疫抗體標(biāo)志物表達(dá)效果最好，抗體標(biāo)記清晰易判，背景干凈（圖2ab）；薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查指定保存液固定、細(xì)胞蠟塊制作試劑盒固定的細(xì)胞蠟塊免疫標(biāo)記染色效果均欠佳，抗體標(biāo)記稍減弱（圖2c-f）。

圖2 免疫組化染色所見[a：10%中性緩沖甲醛和95%乙醇聯(lián)合固定細(xì)胞角蛋白（CK）表達(dá)定位準(zhǔn)確，結(jié)果（+++）；b：10%中性緩沖甲醛和95%乙醇聯(lián)合固定鈣結(jié)合蛋白（CR）表達(dá)定位準(zhǔn)確，結(jié)果（+++）；c：薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查指定保存液固定CK表達(dá)定位準(zhǔn)確，結(jié)果（+）；d：薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查指定保存液固定CR表達(dá)定位準(zhǔn)確，結(jié)果（+）；e：細(xì)胞蠟塊制作試劑盒固定CK表達(dá)定位準(zhǔn)確，結(jié)果（+）；f：細(xì)胞蠟塊制作試劑盒固定CR表達(dá)定位準(zhǔn)確，結(jié)果（+）；×400]

3 討論

發(fā)生在全身或胸腹腔內(nèi)的惡性腫瘤和（或）惡性病變引起胸腔、腹腔的臟層和（或）壁層胸腹膜發(fā)生彌漫性病變，繼而導(dǎo)致體腔內(nèi)液體異常增多的現(xiàn)象，被稱為惡性胸腹水，在臨床上較為常見[8-9]。目前對臨床送檢的體腔積液的檢測方式通常有以下幾種：第一，普通細(xì)胞涂片，操作簡單，報告時間短，是幾乎所有病理科都常規(guī)開展的項目，但與制片人員的技術(shù)水平密切相關(guān)，細(xì)胞取樣層選擇不當(dāng)、涂片厚薄不均等均會影響病理診斷；第二，薄層液基細(xì)胞學(xué)制片術(shù)，尤其在樣本細(xì)胞量比較少的時候，可以通過此方法得到相對理想的高質(zhì)量涂片，但試劑與儀器成本較高，在小型醫(yī)院開展的難度相對較大[10]；第三，細(xì)胞蠟塊技術(shù)，具有保存細(xì)胞新鮮、抗原保留完整等優(yōu)點，且可進(jìn)行多次切片，用于原位雜交、免疫組化染色、分子檢測、藥物分析、臨床實驗等，可提高細(xì)胞學(xué)診斷的陽性率，也可幫助判斷細(xì)胞的來源、分型，有利于評估患者預(yù)后[11-12]。

近年來，已有多種細(xì)胞蠟塊的制作方法[5，13-15]，同時很多廠家也生產(chǎn)出了細(xì)胞蠟塊制作試劑盒，但關(guān)于分析不同固定方法對細(xì)胞蠟塊制作效果影響的文章較少。本研究對同一漿膜腔積液應(yīng)用3種不同的固定方法進(jìn)行細(xì)胞蠟塊的制作。首先，10%中性緩沖甲醛和95%乙醇聯(lián)合固定法，10%中性緩沖甲醛液為交聯(lián)劑，可以與蛋白質(zhì)相互交聯(lián)而發(fā)生沉淀，從而較好地保持細(xì)胞的完整性，穿透性較好，使細(xì)胞收縮小，對大多數(shù)抗原物質(zhì)保存較好，但存在細(xì)胞不易凝結(jié)成塊的缺點，而聯(lián)合使用95%乙醇剛好彌補(bǔ)了這一點，95%乙醇為脂溶性有機(jī)溶劑，可幫助細(xì)胞沉淀凝固成塊，便于細(xì)胞塊的制作。實驗得出此聯(lián)合固定法得到的細(xì)胞蠟塊HE染色鮮艷，能清楚地展現(xiàn)完整的細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)，免疫組化標(biāo)記較為容易判別。其次，薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查指定保存液，是一種以乙醇為基礎(chǔ)的紅色固定劑，其主要成分可以溶解紅細(xì)胞并沉淀蛋白，并含有脂肪酸，實驗過程中發(fā)現(xiàn)此方法固定后細(xì)胞不易取樣包埋，而且所得的蠟塊HE染色中伊紅深染偏紅，部分細(xì)胞空泡化，部分核有固縮現(xiàn)象，免疫組化標(biāo)記效果欠佳。分析原因是固定液中的脂肪酸被醇類變性，會影響蛋白質(zhì)形成超聚集體，不利于包埋等操作，并且可能影響后續(xù)的染色。最后，細(xì)胞蠟塊制作試劑盒，試劑A的作用是迅速殺死細(xì)胞，使其固定，試劑B與樣本混合后成半流體狀，脫水后呈沙粒狀。實驗結(jié)果顯示此方法得到的細(xì)胞塊細(xì)胞量偏少，HE染色細(xì)胞輪廓不清，部分細(xì)胞核重疊比較嚴(yán)重，免疫組化標(biāo)記效果欠佳。并且從成本角度考慮，薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查指定保存液和細(xì)胞蠟塊制作試劑盒成本較高，而10%中性甲醛與95%乙醇是普通及價廉的試劑，相對而言，前兩者檢查費用昂貴，患者經(jīng)濟(jì)壓力較重，在許多小型醫(yī)院無法開展，后者更容易開展。

綜上所述，本文應(yīng)用3種不同固定方法對同一體腔積液制作細(xì)胞富集塊時進(jìn)行固定處理，通過觀察3者細(xì)胞蠟塊HE染色和免疫標(biāo)記定位效果的差異，得出10%中性緩沖甲醛和95%乙醇聯(lián)合固定效果比較滿意，且對抗原的影響較小，因此該法值得廣為推薦。