黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠PI3K/AKT/HIF-1α 軸的影響

陳日裕

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種免疫性疾病,長期得不到有效的治療還會導(dǎo)致機體功能喪失,一旦患病,患者會出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛、腫脹等癥狀,對患者的生活和身體健康產(chǎn)生了極為不利的影響［1］。目前在臨床中治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的主要藥物依然是非幽體抗炎藥和皮質(zhì)激素,這兩類藥物對患者癥狀緩解和病情改善有一定的效果,但如果持續(xù)服用此類藥物對患者身體會產(chǎn)生不利影響［2］。黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊中使用的黑骨藤、清風(fēng)藤、追風(fēng)傘均來源于苗族的民間,有9 成以上的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者經(jīng)黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊得到有效治療。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 此次研究所用的藥物包括由國藥集團老來福(貴州)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊。由上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的PI3K 抑制劑LY294002。大鼠每日給藥黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊的劑量計算與人體120 斤體重為準(zhǔn),給藥量是人體一日服用藥量的7 倍。

1.1.2 動物 選用雄性SD 大鼠,體重180～220 g,均來自于長沙天勤生物技術(shù)有限公司,飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級,室內(nèi)溫度和濕度均按照標(biāo)準(zhǔn)調(diào)節(jié)。動物飼料統(tǒng)一來自長沙天勤生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 試劑 此次實驗選用的試劑包括：由Chond-rex公司生產(chǎn)的牛Ⅱ型膠原；由Sigma 公司生產(chǎn)的完全弗氏佐劑；由Abcam 公司生產(chǎn)的Bcl-2、Bax、HIF-1α、Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C、β-actin 蛋白；由CST 公司生產(chǎn)的p-AKT、p-PI3K 蛋白；由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的山羊抗兔HRG 抗體；由上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的TUNEL 染色試劑盒；由欣博盛生物科技有限公司生產(chǎn)的IL-2、IL-4、IL-17 ELISA 試劑盒；由北京索萊寶生物科技有限公司生產(chǎn)的SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠造模 選用雄性SD 大鼠若干,隨機分為空白組和造模組,將牛Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑配制成混合懸液,造模組大鼠在實驗前1 天和第7 天分別于尾巴根部位置經(jīng)皮下注射該懸液,讓大鼠患類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。誘發(fā)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎后,觀察大鼠足趾關(guān)節(jié)腫脹情況,并對其腫脹程度進(jìn)行評分,大鼠的足踢趾均有輕微腫脹為1 分；大鼠的足踢趾均有較為明顯的腫脹為2 分；大鼠的足踢趾腫脹嚴(yán)重為3 分；大鼠的足踢趾、踩關(guān)節(jié)均腫脹嚴(yán)重或發(fā)生變形為4 分。腫脹評分為2、3、4 分的大鼠表示造模成功。造模成功的大鼠隨機分為3 組,分別為模型組、黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊組以及黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊聯(lián)合PI3K 抑制劑給藥組,每組分得大鼠8 只。空白組大鼠按照其身體重量每日灌胃生理鹽水,模型組、膠囊組、聯(lián)合給藥組每日灌胃給藥羧甲基纖維素鈉配制的混懸液,膠囊組應(yīng)用黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊,黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊聯(lián)合PI3K 抑制劑給藥組應(yīng)用黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊與PI3K 抑制劑,各組均持續(xù)5 周。最后一次給藥后對各組大鼠的足跖部厚度進(jìn)行測量,于大鼠腹部主動脈采取儲存,取適量脾臟置于4%多聚甲醛,其余脾臟置于-80℃環(huán)境下儲存,同側(cè)關(guān)節(jié)滑膜組織以同樣的方式儲存。

1.2.2 后肢足踢部腫脹度測量 經(jīng)厚度測量儀對炎癥誘導(dǎo)前后大鼠兩只后肢足踢部腫脹程度進(jìn)行測量,并做好詳細(xì)登記,根據(jù)等級結(jié)果做進(jìn)一步分析。

1.2.3 蛋白定量 采用BCA 蛋白定量法完成蛋白定量,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠完成濃縮膠和分離膠制備,分別為5%和12%,加入樣品之后在80 V 電壓條件下電泳,持續(xù)2 h,60 V 電壓條件下轉(zhuǎn)膜,持續(xù)2 h,將5%脫脂奶粉在封閉儲存2 h,然后加入第一抗體,內(nèi)參一抗?jié)舛葹?∶8000,其余為1∶1500,用TBST 緩沖液沖洗3 次,加入濃度為1∶7000 的第二抗體,再次沖洗,置入顯影液,利用ImagePro-Plus6.0 軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠治療后不同時期的足踢趾炎性腫脹程度對比 治療前,模型組、黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊組、黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊聯(lián)合PI3K 抑制劑給藥組的足踢趾腫脹程度均高于空白組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。治療后1、2、3、4、5 周,黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊組、黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊聯(lián)合PI3K 抑制劑給藥組的足踢趾腫脹程度均低于本組治療前,且均低于模型組,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但仍不及空白組。見表1。

2.2 四組大鼠的脾臟Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C 蛋白表達(dá)對比 模型組大鼠的脾臟Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C 蛋白表達(dá)顯著高于空白組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但是黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊組和黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊聯(lián)合PI3K抑制劑給藥組大鼠的脾臟Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C 蛋白表達(dá)低于模型組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3 四組大鼠滑膜組織p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)對比 模型組大鼠的滑膜組織p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著高于空白組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊組及黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊聯(lián)合PI3K 抑制劑給藥組大鼠的滑膜組織p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bcl-2 蛋白表達(dá)明顯低于模型組,而Bax 蛋白表達(dá)明顯高于模型組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表1 四組大鼠治療后不同時期的足踢趾炎性腫脹程度對比(,mm)

表1 四組大鼠治療后不同時期的足踢趾炎性腫脹程度對比(,mm)

注：與模型組對比,aP<0.05

表2 四組大鼠的脾臟Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C 蛋白表達(dá)對比()

表2 四組大鼠的脾臟Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C 蛋白表達(dá)對比()

注：與空白組對比,aP<0.05；與模型組對比,bP<0.05

表3 黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊在不同時期對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響()

表3 黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊在不同時期對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響()

注：與空白組對比,aP<0.05；與模型組對比,bP<0.05

3 討論

黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊由貴州同濟堂制藥有限公司生產(chǎn),且為該公司的專利藥物,主要功效是活血通絡(luò)、祛風(fēng)止痛等,但是針對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床治療機制尚無明確定論［3］。該膠囊中含有黑骨藤、清風(fēng)藤、追風(fēng)傘,其中黑骨藤的功效為祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、活血消炎,對風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打損傷、乳腺炎、口腔炎等有良好的治療效果；清風(fēng)藤的功效為通經(jīng)絡(luò)、祛風(fēng)濕、利尿,對關(guān)節(jié)腫脹、風(fēng)濕痹癥、水腫、麻痹瘙癢、腳氣等有良好的治療效果；追分傘的功效為活血止痛、祛風(fēng)通絡(luò)［4］。對風(fēng)濕麻痹、半身不遂、四肢拘攣、骨折、跌撲、小兒驚風(fēng)等有良好的治療效果。相關(guān)文獻(xiàn)也曾對黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊的用藥安全性提出質(zhì)疑,認(rèn)為其有一定的毒副作用［5］。引發(fā)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的因素主要是PI3K-AKT-HIF-1α 信號通路,激活PI3K 蛋白的細(xì)胞因子不僅僅局限于一種,可促進(jìn)細(xì)胞分化、加強代謝和細(xì)胞活力、誘發(fā)炎癥甚至癌癥。AKT 蛋白曾經(jīng)是胰島素細(xì)胞信號的存在,可以反應(yīng)細(xì)胞生長、細(xì)胞增殖等情況,并于PI3K 蛋白下游激活,引發(fā)一些列蛋白反應(yīng)［6］。HIF-1α 不受組織損傷影響,以含氧量為依據(jù)完成營養(yǎng)供應(yīng)和血管增生,快速反應(yīng)機體供養(yǎng)狀況。針對炎癥、血氧含量不足的疾病中,HIF-1α 無法正常完成降解,經(jīng)轉(zhuǎn)移后結(jié)合HIF-1β,最終形成二聚體,激活下游蛋白,幫助新生血管生成［7］。

大鼠造模完成后,相較于空白組,模型組大鼠的足跖部炎性腫脹程度嚴(yán)重,膠囊組大鼠經(jīng)黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊治療后,足跖部炎性腫脹情況得到明顯緩解,聯(lián)合給藥組大鼠經(jīng)黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊聯(lián)合PI3K 抑制劑治療后,二者的協(xié)同作用得到有效的發(fā)揮,讓炎癥難以進(jìn)一步加重。模型組大鼠的脾臟Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C 蛋白表達(dá)顯著高于空白組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但是黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊組和黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊聯(lián)合PI3K 抑制劑給藥組大鼠的脾臟Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C蛋白表達(dá)低于模型組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組大鼠的滑膜組織p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著高于空白組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊組及黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊聯(lián)合PI3K 抑制劑給藥組大鼠的滑膜組織p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bcl-2 蛋白表達(dá)明顯低于模型組,而Bax 蛋白表達(dá)明顯高于模型組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明,黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊以及黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊聯(lián)合PI3K 抑制劑治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的腫脹問題雖然有一定的效果,但是無法根治。黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊以及黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊聯(lián)合PI3K 抑制劑可有效降低脾臟Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C 蛋白表達(dá),讓大鼠的滑膜細(xì)胞加速凋亡。

綜上所述,黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊可影響類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中PI3K/AKT/HIF-1α 信號通路的表達(dá),引發(fā)多種細(xì)胞和蛋白調(diào)節(jié)。