基于網絡藥理學探討丹參酮ⅡA治療缺血性中風的機制研究

鐘達源，李蘭，馬若夢，蔣成婷，鄧奕輝

(湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208)

根據世界衛生組織的報告，中風是全球第二大死亡原因[1]。僅在2016年，就有約550萬人死于中風[2]。根據中國最新的人口普查結果，中國的中風發生率約為1.6%，其中缺血性中風(IS)占21.4%[3]。循證醫學研究表明，大部分缺血性中風是由于血凝塊阻塞腦血管而引起的[4]，血漿纖維蛋白原升高是腦血管疾病的重要致病因素[5], 其含量升高會引起血漿黏度上升,增加紅細胞和血小板聚集性,提高全血黏度,促使血栓形成，從而導致缺血性事件的發生。研究表明，在缺血性腦血管病患者及其高危人群中，凝血酶活性普遍增強[6]。動物實驗發現，在大腦中動脈閉塞大鼠模型的缺血中心區域，凝血酶的活性顯著增加，凝血酶原基因表達上調[7]。體外實驗顯示，凝血酶的非蛋白水解活性可以激活小膠質細胞[8]，增強小膠質細胞吞噬作用，從而對神經元造成損傷[9]。中醫學并無缺血性中風這一病名，根據其癥狀表現，將其歸屬于 “中風”，其發病多責之于“虛、風、火、痰、瘀”[10]。后世醫家更強調“瘀”的作用[11]。丹參是雙子葉唇形科植物丹參的干燥根和根莖,具有活血化瘀的功效。丹參酮ⅡA是從丹參的根中分離出的二萜醌,對IS的治療具有確切療效。董玉寶[12]的研究發現，丹參酮ⅡA聯合尼莫托普治療創傷性腦梗死的臨床療效明顯提高。有Meta分析結果表明，丹參酮ⅡA治療可改善IS急性期的神經功能缺損評分和患者的日常生活活動[13]。何曉靜等[14]發現丹參酮ⅡA可以延長斷頭后小鼠的生存時間，增加斷頭后的喘息次數，改善中風小鼠的神經行為,增加小鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織中SOD酶的活性，并降低MDA含量。這種保護作用可能是由于丹參酮ⅡA降低了受損組織的ROS因子含量，從而減少了受損組織的氧化應激損傷，并最終減輕了腦缺血后的炎癥損傷[15]。這表明丹參酮ⅡA具有抗炎、抗氧化和抗凋亡作用，對IS具有神經保護作用。目前，針對丹參酮ⅡA治療IS的研究逐漸深入，但尚無針對其起效的具體分子作用機制的研究。因此本文基于網絡藥理學研究方法，對丹參酮ⅡA治療IS的分子靶點及通路進行預測，并通過分子對接進行了驗證。

1 材料和方法

1.1 材料

PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/#query=Loxanol%20V)[16]，PharmMapper數據庫(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html)[17]，UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)[18]，GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/Search/Keyword?queryString=coronavirus)[19]，Protein-Ligand Interaction Profiler數據庫(https://plip.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index)[20],Cytoscape3.6.1軟件[21]，OpenBabel-2.4.1軟件[22]，Ledock軟件[23]，Pymol軟件[24]。

1.2 丹參酮ⅡA靶點的收集與處理

通過PubChem數據庫查找丹參酮ⅡA的3D結構，并導入到PharmMapper數據庫中以預測其分子靶點。將預測得到的丹參酮ⅡA靶點名由UniProt數據庫中的UniProtKB搜索功能進行注釋，并且通過String數據庫構建了蛋白質相互作用網絡(PPI)。通過GeneCards數據庫搜索3 350個IS疾病目標，并將PPI網絡中包含的丹參酮ⅡA靶點與IS疾病靶點進行相交取共同子集，從而獲得丹參酮ⅡA治療IS的靶點。

1.3 丹參酮ⅡA治療IS關鍵靶點的GO和KEGG富集分析

將丹參酮ⅡA治療IS的關鍵靶點通過R軟件的clusterProfiler[25]程序包進行了GO和KEGG富集分析，篩選有關通路，剔除無關通路；根據靶點在通路上的富集定位，整合所有通路，構建丹參治療糖尿病神經病變靶點通路圖。

1.4 丹參酮ⅡA與16個關鍵疾病靶點的分子對接

從PDB數據庫下載了關鍵蛋白質的pdb結構文件，并通過Ledock軟件對其進行脫配體加氫處理。然后通過PubChem數據庫下載丹參酮ⅡA的sdf格式文件，并通過OpenBabel-2.4.1轉換為mol文件。用Ledock軟件計算丹參酮ⅡA與16個關鍵靶點的分子對接能，并通過Pymol軟件和Protein-Ligand Interaction Profiler數據庫進行可視化。

2 結果

2.1 網絡藥理研究流程圖

從PubChem數據庫獲取化合物的3D結構，將其導入PharmMapper數據庫以預測化合物的靶點。然后從UniProt數據庫中獲得基因注釋信息，并將靶點信息導入String數據庫中以構建靶點PPI網絡。從GeneCards數據庫下載IS靶點數據，在與藥物靶點相交后獲得藥物治療IS的靶點。用Cytoscape軟件構建網絡后，可以通過網絡分析功能進行網絡拓撲分析以篩選關鍵靶點。通過R軟件的clusterProfiler軟件包分析丹參酮ⅡA治療IS的關鍵靶點，并進行GO和KEGG富集分析。再通過Ledock軟件進行丹參酮ⅡA與關鍵靶點的分子對接，最后通過Pymol軟件和Protein-Ligand Interaction Profiler數據庫進行可視化分析，流程見圖1。

圖1 網絡藥理研究流程圖

2.2 丹參酮ⅡA靶點預測及靶點PPI網絡的構建

通過PubChem數據庫搜索丹參酮ⅡA的3D結構，并將其導入PharmMapper數據庫以預測其分子對接目標。以Normfit>0.6作為篩選條件，篩選出82個丹參酮ⅡA靶點，并將其導入到String數據庫中構建PPI。以combined score>0.7作為優化PPI網絡的條件，獲得了70種靶蛋白之間的相關網絡，如圖2所示。

圖2 丹參酮ⅡA靶點的PPI網絡

2.3 丹參酮ⅡA-靶點-IS網絡構建

將PPI網絡中包含的70個靶點與3 350個IS疾病靶點相交取共同子集,得到丹參酮ⅡA治療IS靶點55個。基于以上結果，構建“丹參酮ⅡA-靶點-IS”關系網絡，如圖3所示。該網絡包含72個節點和303個邊，平均度數為4.21。以Degree>10作為篩選條件，獲得了丹參酮ⅡA治療IS的16個關鍵靶點，包括MAPK1、MAPK8、EGFR、SRC、HSP90AA1、ESR1、ALB、MAPK14、CASP3、AR、RXRA、PGR、CTNNA1、CDK2、NOS3和KDR，如表1所示。

2.4 GO富集分析

用R軟件的clusterProfiler[25]程序包對丹參酮ⅡA治療IS的16個關鍵目標進行GO富集分析，獲得了87個相關的GO條目。通過P<0.001的篩選，得到26條主要參與丹參酮ⅡA治療IS的GO項目。主要包括核受體活性、配體激活的轉錄因子活性、類固醇激素受體活性、MAP激酶活性、支架蛋白結合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、ATPase結合、β-catenin結合、類固醇結合、MAP激酶激酶活性和其他生物學功能。見表2。

圖3 丹參酮ⅡA-靶點-IS關系網絡圖

表1 丹參酮ⅡA治療IS的關鍵靶點

2.5 KEGG富集分析

通過R軟件的clusterProfiler[25]程序包進行KEGG富集分析，結果顯示丹參酮ⅡA治療IS主要涉及 9條KEGG信號通路。主要包括內分泌抗性、FoxO信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抵抗、MAPK信號通路、ErbB信號通路、Rap1信號通路、Ras信號通路、HIF-1信號通路和鉑類藥物抗性。見表3。

表2 丹參酮ⅡA在IS治療中GO富集分析結果

表3 丹參酮ⅡA治療IS的KEGG富集分析結果

2.6 丹參酮ⅡA與靶蛋白的分子對接得分及結構

丹參酮ⅡA與16種靶蛋白分子對接。從PubChem數據庫下載了tanshinoneⅡA的sdf格式文件，然后通過OpenBabel-2.4.1轉換為mol文件。從Pdb數據庫下載目標蛋白的pdb結構文件，并通過Ledock軟件進行去除配體和加氫處理后進行分子對接。結果顯示，丹參酮ⅡA與PGR、CDK2、MAPK1、KDR和EGFR的分子對接分數均小于-5 kcal/mol，這表明丹參酮ⅡA與這些靶點的對接結構相對穩定，如表4。通過Pymol軟件可視化對接結構，該結構如圖4～8所示。

丹參酮ⅡA與PGR的親和能為-5.29 kcal/mol，低于-5 kcal/mol，表明丹參酮ⅡA對PGR具有很強的親和力。丹參酮ⅡA占據了由PGR蛋白中LEU-797、LEU-763、PHE-778、LEU-718和LEU-887殘基形成的活性腔。丹參酮ⅡA分子與LEU-797、LEU-763、LEU-718和LEU-887的殘基形成疏水鍵。此外，丹參酮ⅡA和PHE-778殘基形成π堆積，如圖4所示。

表4 丹參酮ⅡA與16種靶蛋白的分子對接分數表

圖4 丹參酮ⅡA和PGR的分子對接結構圖

丹參酮ⅡA和CDK2親和能為-5.16 kcal/mol，低于-5 kcal/mol，表明丹參酮ⅡA對CDK2具有很強的親和力。丹參酮ⅡA占據了CDK2蛋白中LYS-89、ILE-10、VAL-18、VAL-64、PHE-80和LEU-887殘基組成的活性腔。丹參酮ⅡA分子與LYS-89形成氫鍵。丹參酮ⅡA與殘基,如ILE-10、VAL-18、VAL-64、PHE-80和LEU-887形成多個疏水鍵。如圖5所示。

丹參酮ⅡA與MAPK1親和能為-5.04 kcal/mol，低于-5 kcal/mol，表明丹參酮ⅡA與MAPK1有很強的親和力。丹參酮ⅡA占據了MAPK1蛋白中由MET-108、LEU-156和ILE-31殘基組成的活性腔。丹參酮ⅡA分子與MET-108形成氫鍵。丹參酮ⅡA與殘基(如LEU-156和ILE-31)形成疏水鍵。如圖6所示。

丹參酮ⅡA與KDR的親和能為-5.02 kcal/mol，低于-5 kcal/mol，表明丹參酮ⅡA對KDR具有很強的親和力。丹參酮ⅡA占據了KDR蛋白中的殘基(如PHE-916、PHE-105、CYS-917、VAL-914、ALA-864、LEU-1033和LEU-838)形成的活性腔。丹參酮ⅡA分子與CYS-917形成氫鍵。丹參酮ⅡA與殘基,如PHE-916、PHE-105、VAL-914、ALA-864、LEU-1033和LEU-838形成疏水鍵。如圖7所示。

圖5 丹參酮ⅡA和CDK2的分子對接結構圖

圖6 丹參酮ⅡA和MAPK1的分子對接結構圖

圖7 丹參酮ⅡA和KDR的分子對接結構圖

丹參酮ⅡA與EGFR的親和能為-5 kcal/mol，表明丹參酮ⅡA對EGFR具有很強的親和力。丹參酮ⅡA占據了EGFR蛋白中LEU-844、MET-793和LEU-718殘基形成的活性腔。丹參酮ⅡA分子與MET-793形成氫鍵。丹參酮ⅡA與殘基(如LEU-844和LEU-718)形成疏水鍵。如圖8所示。

圖8 丹參酮ⅡA和EGFR的分子對接結構圖

3 討論

缺血性中風(IS)是造成死亡、后天性殘疾的常見原因[26]。其發病機理主要是由于動脈硬化導致的血液流動變緩，血液成分改變和血液黏度增加。因此治療的關鍵是盡快改善缺血區域的血液循環，消除繼發性水腫，恢復腦細胞的正常代謝和神經功能。目前針對該病的治療主要是通過動靜脈溶栓、非支架式機械取栓術和支架式機械取栓術的治療[27]。其中靜脈藥物溶栓治療時間較嚴格(急性腦血管閉塞3～4.5 h)，大動脈閉塞再通率低，治療效果較差。而繼發于急性腦血管閉塞的腦梗死主要是由腦動脈狹窄的大量血栓形成所致。即使溶栓后血管再次暢通，但仍會發生再次阻塞的問題[28]。不僅如此，長期應用溶栓藥容易誘發顱內出血。其中靜脈內溶栓導致顱內出血的發生率約為6.4%，而動脈溶栓的發生率則接近10%。這使得病情轉向惡化，因此治療效果不是特別理想[29-30]。為此有必要尋找更為有效的藥物對其進行治療，中藥丹參及其提取物已廣泛用于心腦血管疾病的治療[31]。動物實驗研究發現，丹參中所含的丹參酮可以有效抵抗中樞神經系統的缺血性損傷，并保護缺血區域的神經元，減少由缺血再灌注引起的延遲性神經元凋亡，減少水腫，縮小腦梗塞范圍，并改善腦缺血引起的神經系統癥狀。有研究發現[32],作為丹參的主要活性成分之一的丹參酮ⅡA對大鼠短暫性局灶性腦缺血具有顯著的保護作用，對永久性局灶性腦缺血同樣具有良好的保護作用[33]。盡管已有大量研究證實丹參酮ⅡA對IS的治療作用，但IS是一個復雜的疾病，其病變涉及多個臟腑、多種病機途徑及多條信號通路。目前雖然已經有大量研究肯定了丹參酮ⅡA對IS的治療作用，但丹參酮ⅡA中包含靶點眾多，要想明確丹參酮ⅡA治療IS的機制就顯得困難重重，網絡藥理學是通過分析大數據來進行藥物研究的新模式[34-35]，通過網絡藥理學方法，可以預測丹參酮ⅡA治療IS的靶點以及機制，從而指導丹參酮ⅡA治療IS的研究方向。

網絡拓撲分析結果表明，蛋白PGR、CDK2、MAPK1、KDR、EGFR、ALB、ESR1、CASP3、HSP90AA1、MAPK8、NOS3、RXRA、AR、CTNNA1、MAPK14及SRC關聯度較高，表明這些蛋白是丹參酮ⅡA治療IS的關鍵靶點。GO富集分析結果發現中藥丹參酮ⅡA治療IS涉及多個生物功能，主要參與核受體活性、配體激活的轉錄因子活性、類固醇激素受體活性、MAP激酶活性、支架蛋白結合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、ATPase結合、β-catenin結合、類固醇結合和MAP激酶激酶活性。核受體是一種重要的轉錄因子，在各種生命活動中起調節作用。大多數核受體是配體依賴性轉錄因子，可以被外源性物質和內源性化合物識別并激活。不僅如此與配體結合的核受體可還以調節靶基因的表達和活性從而影響藥物的藥代動力學和藥效過程[36]。有研究表明[37-38],核受體在中藥的代謝和中藥的相互作用中起著重要的調節作用。絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)在應激反應(例如炎癥和細胞凋亡)中起重要作用。凋亡是導致神經元死亡的主要方法之一[39]，這對于人體清除受損細胞并維持生命具有重要意義。在缺血性腦損傷期間，神經元壞死和細胞凋亡同時發生。壞死主要發生在中央缺血區域，而凋亡主要發生在半明半暗帶區域。半明半暗帶是梗塞周圍的腦組織，它的一部分功能受損，但可修復。丹參酮ⅡA可以保護該區域的神經元并減少腦梗塞區域。選擇性神經元死亡通常發生于缺血性損傷后3～4 d。這種現象稱為延遲神經元死亡(DND)。DND與細胞凋亡的發生密切相關[40]。已經發現許多參與細胞凋亡信號調節的蛋白質，其中Bcl-2基因家族在細胞凋亡的線粒體途徑中起著重要的調節作用。該家族包括促進凋亡的蛋白質和抑制凋亡的蛋白質。Caspase-3被認為是細胞凋亡最關鍵的凋亡蛋白酶。Caspase-3的激活最終將導致細胞凋亡。如果可以通過抑制細胞凋亡基因的表達或減少細胞凋亡相關蛋白的表達來抑制細胞凋亡過程，則有可能減少腦缺血期間神經元死亡的數量。而丹參酮ⅡA可以顯著減少梗塞區域周圍神經元的凋亡數量、抑制Caspase-3的活性并增加Bcl-2的表達[41]，這表明丹參酮ⅡA可以通過抑制細胞凋亡來保護神經元免于缺血和缺氧。

KEGG富集分析結果表明，丹參酮ⅡA治療IS主要涉及內分泌抵抗、FoxO信號傳導、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抵抗、MAPK信號傳導、ErbB信號傳導、Rap1信號傳導、Ras信號傳導、HIF-1信號通路和鉑類藥物耐藥性。最新研究還發現Ras信號通路[42]、FoxO信號通路[43]和MAPK信號通路[44]與IS的發病機理密切相關。許多研究表明，有絲分裂原激活的蛋白激酶信號通路(MAPKs)參與細胞內炎癥和細胞存活的調節[45]，而由細胞外信號調節激酶(ERK)介導的信號通路調節Bax/Bcl-2/Bcl-xL的表達在腦缺血再灌注損傷引起的細胞凋亡過程中起重要作用[46]。進一步的研究表明，聚乙二醇納米丹參酮ⅡA與陽離子化牛血清白蛋白聯合使用可以顯著降低ERK1/2基因的表達水平和相應的蛋白表達[47]，這表明丹參酮ⅡA的抗凋亡作用是與MAPK信號通路的調節有關，而這也從反面驗證了本研究結果的準確性。表明本研究結果可為丹參酮ⅡA治療IS的后續研究提供重要依據，而這也將對未來論證中醫藥基礎理論的科學性提供有價值的參考。但因網絡藥理學研究方法的局限性，此研究的部分結果可能欠缺嚴謹，仍需進一步的細胞實驗、動物實驗以及臨床研究進行驗證。