瘡瘍Ⅰ號外敷對大鼠糖尿病性潰瘍的影響

梁學威，苑海剛，于天一

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

隨著人民群眾生活水平的日益提高，我國人口的飲食結構發生了巨大改變，伴隨著這些改變，糖尿病發病率逐年增高，據統計，我國糖尿病發病率從1980年的不足1%，發展到2010年的超過10%，近年來還有進一步上升的勢頭[1]。

皮膚是糖尿病這個多系統疾病的一個復雜的靶器官。糖尿病患者因周圍神經病變與外周血管疾病合并外來的機械壓力，可引起軟組織破壞，進而引發一系列問題，從輕度的神經癥狀、血管疾病到嚴重的潰瘍、感染。根據Wrobel J S及Alavi A等的研究，糖尿病患者一生中有15%～25%的幾率發生糖尿病性潰瘍，一旦發生，創面遷延不愈，在經有效醫學干預的條件下，5年復發率仍高達50%～70%，糖尿病患者因糖尿病性潰瘍所導致的截肢率是普通人群的15倍以上[2-3]。該類截肢是目前非創傷截肢的主要原因之一。Pinto A等在其研究中認為,糖尿病性潰瘍患者截肢后的病死率也明顯升高，術后5年內的病死率高達70%[4]。

西醫治療該病常用以下方案：①代謝管理治療，包括胰島素或胰島素聯合其他藥物等；②改善局部供血治療，包括擴張血管藥物、抗血小板及抗凝藥物等；③手術治療，包括下肢動脈腔內介入治療(球囊擴展及支架等)、下肢動脈旁路移植等；④抗感染及抗炎治療，包括應用各類抗生素等；⑤其他對癥支持，包括止痛等[5-7]。但到目前為止，本病治療方法沒有取得更進一步的突破。

近年來越來越多的研究指出，從目前的臨床實踐和研究進展來看，中醫藥治療糖尿病性潰瘍顯現出一定的優勢[8-9]。黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院趙鋼教授經過長期的臨床經驗積累，創制了外用中藥湯劑——瘡瘍Ⅰ號，用于糖尿病性潰瘍的治療，已經在臨床工作中獲得較好的效果。本研究觀察該方外敷對大鼠糖尿病性潰瘍的影響，旨在進一步驗證其有效性。

1 實驗材料與實驗方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar雄性大鼠(南京君科生物科技有限公司)，選取1月齡，體質量(100±20)g，共30只。

1.2 分組方法

隨機分成6組，每組各5只，將各組分別命名為：實驗1組(A1組)、實驗2組(A2組)、對照1組(B1組)、對照2組(B2組)、空白1組(C1組)和空白2組(C2組)。將A1、A2、B1、B2等4組，合計20只，進行建模；C1、C2等2組，合計10只,不建模。

1.3 飼養與建模

1.3.1 飼養條件

大鼠進食采用江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司生產的實驗用鼠60%脂肪供能高脂飼料，自由采食及飲水，室內自然晝夜照明，通風良好，室溫18～23 ℃，相對濕度55%～75%。以該高脂飼料飼養4周。

1.3.2 糖尿病模型制備

禁食12 h，不禁水，4 ℃檸檬酸鈉(北京酷來搏科技有限公司)緩沖液(0.1 mol/L，pH=4.5)稀釋STZ (北京酷來搏科技有限公司)，35 mg/kg 一次性腹腔注射。72 h后使用血糖儀測量大鼠尾尖血糖，以隨機血糖持續>16.7 mmol/L作為糖尿病大鼠成模標準。每2周測量一次尾尖血糖，隨機血糖<16.7 mmol/L的大鼠予以剔除，對于血糖>27.0 mmol/L的大鼠，予精蛋白鋅胰島素注射液2 u，每日1次皮下注射，以保持糖尿病大鼠血糖水平穩定，從而排除血糖因素的影響并降低糖尿病大鼠的病死率。

1.3.3 糖尿病性潰瘍模型制備

糖尿病大鼠飼養4周后，使用3%的戊巴比妥鈉(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)溶液腹腔注射，使其麻醉，置仰臥位，用橡皮筋將其固定于手術板上。將糖尿病大鼠麻醉后背部備皮，作直徑2.0 cm的圓形標記，在無菌條件下，用砂紙磨去標記處全層皮膚，并深達筋膜，形成創面，止血后充分暴露48 h，即成糖尿病性潰瘍大鼠模型。

1.4 瘡瘍Ⅰ號藥劑制備

選用黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院中藥局提供的飲片進行藥物制備，飲片符合《中華人民共和國藥典》2020版相關標準。組方：連翹100 g，黃芩50 g，赤芍30 g，當歸30 g,苦參30 g。共5味，飲片加水2 000 mL浸泡24 h，武火煮沸后改用文火煎煮120 min，用紗布濾出煎液保存備用，再加水2 000 mL，同法煎煮，用紗布濾出煎液保存備用。將2次煎液均勻混合，減壓濃縮至50 mL，置于4 ℃冰箱保存。外用前提前取出藥液，放置至常溫后使用。

1.5 治療方法

實驗組(A1、A2組)：均局部應用中藥瘡瘍Ⅰ號無菌紗條外敷、無菌紗布包扎、塑料薄膜外包。

對照組(B1、B2組):無菌紗條外敷、無菌紗布包扎、塑料薄膜外包。

空白組(C1、C2組):不建模，僅進行麻醉及足部備皮，用無菌紗條外敷、無菌紗布包扎、塑料薄膜外包。

所有大鼠均每2日換藥1次。

1.6 創面宏觀指標

觀察潰瘍治療前后的面積差異，共進行2次，于治療第15天和第30天分別測量，第15天測量A1、B1、C1組，第30天測量A2、B2、C2組。

方法：到達規定日期后，乙醚麻醉大鼠，使用透明薄膜覆蓋于創面表面，在薄膜表面用藍色記號筆延創面外緣進行標記，取下薄膜，則得創面輪廓線。再將該薄膜覆蓋于方格紙上，計取輪廓線內方格數，使用方格計數法求得面積(C組無創面，數值為0)。

1.7 超敏C-反應蛋白水平

觀察潰瘍治療前后的血液超敏C-反應蛋白(hs-CRP)水平。共進行2次，于治療后的第15天和第30天測量，第15天測量A1、B1、C1組，第30天測量A2、B2、C2組。方法：①使用已在前一步中麻醉并計取創面面積的大鼠。②取尾尖血后，使用標準試劑盒(合肥萊爾生物科技有限公司)，測得超敏C-反應蛋白水平。

1.8 創面炎性因子指標

觀察潰瘍治療前后的創面促炎因子水平，包括促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18)和抑炎因子(IL-4、IL-10)。共進行2次，于治療后的第15和第30天測量，第15天測量A1、B1、C1組，第30天測量A2、B2、C2組。方法：①將已在前一步中采集尾尖血后的大鼠處死。②使用組織鉗夾取創面邊界組織(C1、C2組取背部包扎部位皮下組織)。③使用ELISA標準試劑盒，測得相應炎癥因子指標。

1.9 創面組織中NF-κB通路指標

觀察潰瘍治療前后NF-κB蛋白表達水平。共進行2次，于治療后的第15天和第30天測量，第15天測量A1、B1、C1組，第30天測量A2、B2、C2組。方法：①使用前一步中取得的組織。②稱取約100 mg，加入RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司)200 mL，蛋白酶抑制劑PMSF(北京酷來搏科技有限公司)6 μL。③充分勻漿，以3 000 r/min離心20 min，吸取上清，即得蛋白質。④每個樣品取30 μg總蛋白上樣，經12%SDS-PAGE電泳，電轉膜70 min (電壓為110 V)，5%脫脂奶粉封閉3 h，一抗孵育過夜(NF-κB-p65為 1∶1 000，β-actin為1∶1 000)，TBST洗膜3次，相對應羊抗兔二抗孵育1 h，ECL法顯影(試劑均來自南京森貝伽生物科技有限公司)。⑤采用Quantity One軟件對蛋白條帶進行結果分析。

NF-κB蛋白相對表達量=NF-κB-p65蛋白的灰度值/內參蛋白條帶灰度值

1.10 統計學處理

2 結果

2.1 創面宏觀指標比較

治療第15天和第30天，C組(包括C1、C2)未建模，健康無異常。A組(包括A1、A2)潰瘍面積均有縮小。 A1與B1比較，A2與B2比較，潰瘍面積縮小均具有統計學意義(P<0.05)。提示，瘡瘍Ⅰ號外敷能夠促進創面愈合，減小創面面積。各階段各組創面面積如表1所示。

表1 各階段各組創面面積比較

2.2 臨床炎癥指標比較

治療第15天和第30天，A1、B1兩組與C1組比較，A2、B2兩組與C2組比較，臨床炎癥指標(hs-CRP)均升高(P<0.05)。A1與B1比較，A2與B2比較，臨床炎癥指標降低均具有統計學意義(P<0.05)。提示，瘡瘍Ⅰ號外敷能夠在一定程度上降低臨床炎癥指標(hs-CRP)，控制機體炎癥水平。各組hs-CRP水平如表2所示。

表2 各組hs-CRP水平比較

2.3 創面促炎因子指標比較

治療第15天和第30天，A1、B1兩組與C1組比較，A2、B2兩組與C2比較，創面組織促炎因子(包括TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18)水平均升高(P<0.05)。A1與B1比較，A2與B2比較，創面組織促炎因子水平下降均具有統計學意義(P<0.05)。提示，瘡瘍Ⅰ號外敷能夠在一定程度上降低創面局部促炎因子水平，抑制組織炎癥。各組促炎因子水平如表3所示。

表3 治療第15天和第30天各組促炎因子水平比較

2.4 創面抑炎因子指標比較

治療第15天和第30天，A1、B1兩組與C1組比較，A2、B2兩組與C2組比較，創面組織IL-4水平均有降低(P<0.05)。A1與B1比較，A2與B2比較，IL-4水平升高均具有統計學意義(P<0.05)。

治療第15天和第30天，A1、B1兩組與C1組比較，A2、B2兩組與C2組比較，創面組織IL-10水平均有升高(P<0.05)。A1與B1比較，A2與B2比較，IL-10水平升高均具有統計學意義(P<0.05)。提示：瘡瘍Ⅰ號外敷能夠在一定程度上提高創面局部抑炎因子水平，抑制組織炎癥。各組促炎因子水平如表4所示。

表4 治療第15天和第30天各組抑炎因子水平比較

2.5 創面組織中NF-κB-p65蛋白表達水平的比較

治療第15天和第30天，A1、B1兩組與C1組比較，A2、B2兩組與C2組比較，NF-κB-p65蛋白表達水平均升高(P<0.05)。A1與B1比較，A2與B2比較，創面NF-κB-p65蛋白表達水平下降均具有統計學意義(P<0.05)。提示，瘡瘍Ⅰ號外敷能夠在一定程度上降低創面局部組織中NF-κB-p65蛋白的表達水平，抑制NF-κB通路，抑制炎癥反應。各組NF-κB-p65蛋白的表達水平如表5所示。

表5 治療第15天和第30天各組NF-κB-p65蛋白的表達水平比較

3 討論

瘡瘍Ⅰ號組方為連翹100 g,黃芩50 g,赤芍30 g,當歸30 g,苦參30 g，共5味。方中連翹具有清熱解毒、消腫散結之功效，在本方中清熱解毒，攻創面之毒，取邪去則正安之意，為君藥。黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效，輔助連翹，進一步增強清熱解毒之功效，為臣藥。赤芍具有清熱涼血、散瘀止痛之功效，在本方中一方面協助連翹、黃芩清熱，另一方面涼血化瘀，解除瘀阻，恢復局部血脈運行，為佐藥。當歸具有補血活血之功效，與赤芍合用，成活血化瘀之勢，調理血脈，使血行通暢以養筋肉，為佐藥。苦參具有清熱燥濕之功效，一方面協助連翹、黃芩、赤芍以清熱，另一方面燥濕創面，使腐肉得生，為佐藥。諸藥合用，以清熱解毒、活血化瘀為基本治法，針對糖尿病性潰瘍患者局部最常見的濕熱下注之證進行治療。

從現代醫學的角度看，連翹具有降低NF-κB-p65表達，同時使MCP-1和IL-6表達水平下降的作用[10-14]。黃芩中的有效成分——黃芩素,可以通過減輕腎臟細胞炎癥來延緩糖尿病腎病的進展，且與抑制炎癥信號NF-κB通路的激活密切相關[15-19]。當歸中的有效成分——當歸多糖,可顯著改善糖尿病神經病變大鼠的周圍神經損傷狀態，促進神經傳導的恢復，其機制可能與阻斷NF-κB信號路徑的傳導，降低炎性因子水平，減輕神經的氧化應激損傷有關[20-22]。

由上述內容可以導出，瘡瘍Ⅰ號應用于大鼠糖尿病性潰瘍時所表現出的治療作用，可能與其抑制了NF-κB-p65蛋白的表達水平，抑制NF-κB信號通路，進而在降低了創面局部促炎因子水平的同時提高了抑炎因子的水平，最終抑制了炎癥水平有關。

本實驗結果中，實驗組與對照組比較，潰瘍面積縮小、臨床炎癥指標降低、創面組織促炎因子水平下降、創面抑炎因子水平升高均具有統計學意義(P<0.05)，創面NF-κB-p65蛋白表達水平下降方面均具有統計學意義(P<0.05)。分別在宏觀層面、臨床指標層面、細胞因子層面、核因子蛋白層面驗證了上述假設。

綜上所述，應用瘡瘍Ⅰ號外敷，能夠在一定程度上促進糖尿病性潰瘍的創面愈合，具體表現為治療前后局部創面面積的縮小、局部組織促炎因子水平降低、抑炎因子水平升高、血清hs-CRP降低。其機制可能與組方藥物中的有效成分抑制了NF-κB信號通路有關，但具體治療機理還需要進一步研究。