一株MDBK細胞的低血清懸浮馴化研究

王 磊，楊承槐，劉 瑩

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

MDBK細胞(Madin-Darby Bovine Kidney Cells，MDBK)是由S H Madin和N B Darby于1953年從美國一頭健康的成年公牛腎臟組織中分離培養(yǎng)建立的貼壁培養(yǎng)型傳代細胞系[1]。該細胞系對多種病原(牛病毒性腹瀉病毒、傳染性牛鼻氣管炎病毒、偽狂犬病毒等)易感[2-3]，被廣泛用于病毒感染、檢測和培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其用于傳染性牛鼻氣管炎病毒的增殖，病毒感染效率高、增殖快且不易變異，是公認的適合生產(chǎn)傳染性牛鼻氣管炎疫苗的細胞基質(zhì)[4]。但是，以MDBK細胞作為生產(chǎn)基質(zhì)的相關(guān)疫苗，由于其貼壁生長特性的限制，多采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方式和微載體培養(yǎng)方式進行生產(chǎn)，生產(chǎn)周期長，下游工藝相對復(fù)雜，工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的難度較大。因此馴化全懸浮的MDBK細胞具有十分重要的現(xiàn)實意義。

懸浮細胞是指生長不依賴支持物表面,可在液體培養(yǎng)基中呈懸浮狀態(tài)生長的細胞。與貼壁細胞相比，懸浮細胞盡量減少或避免了動物源性血清的添加，使其具有更好的傳代穩(wěn)定性和安全性[5]，同時還具備了可線性放大培養(yǎng)的優(yōu)勢，是實現(xiàn)生物反應(yīng)器大規(guī)模、高效率生產(chǎn)的前提條件[6-7]。懸浮培養(yǎng)基的使用還徹底擺脫了細胞貼附基質(zhì)，可以有效地簡化下游分離純化工藝的難度，節(jié)約設(shè)備空間，縮短生產(chǎn)時間，降低生產(chǎn)成本[8]。本試驗對一株貼壁的MDBK細胞進行了全懸浮馴化研究，以期為相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的升級改進提供細胞學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和毒株 MDBK細胞(第9代，批號20170623)、偽狂犬病毒(Bartha-K61株)、傳染性牛鼻氣管炎病毒(AV21株)由國家獸醫(yī)微生物菌種中心鑒定保藏。

1.1.2 主要試劑和耗材 DMEM(Gibco，批號8119416)、0.25%胰蛋白酶(Gibco，批號1953147)、懸浮培養(yǎng)基(MDBK-SLM)、胎牛血清(PAN，批號ST170802)、臺盼藍染液(sigma，批號RNBG9718)。

1.1.3 主要儀器 Hettich離心機(型號320R)、Thermo CO2培養(yǎng)箱(型號Heracell 240i)、Nikon倒置顯微鏡(型號TS100)、Biomedical多通道生化分析儀(型號 NOVA400)、infors振蕩型CO2培養(yǎng)箱(型號 Minitron)、Countstar細胞計數(shù)儀(型號Auto T4)。

1.2 方法

1.2.1 貼壁MDBK細胞在低血清培養(yǎng)基中懸浮馴化培養(yǎng) 取培養(yǎng)成良好單層的MDBK細胞，消化后收集細胞培養(yǎng)物懸液進行細胞計數(shù)，1000 r/min離心10 min，收集細胞沉淀。將細胞沉淀按照初始密度1×106/mL用40 mL低血清培養(yǎng)基(含2%胎牛血清)重懸，置于125 mL三角搖瓶中，110 r/min、37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。每24 h取樣計數(shù)，培養(yǎng)至48 h處理，若48 h細胞密度高于2×106/mL，使用含2%胎牛血清的培養(yǎng)基稀釋細胞至1×106/mL，若48 h細胞密度低于2.0×106/mL，1000 r/min離心10 min后，更換新鮮培養(yǎng)基，直至每48 h可以正常稀釋傳代，連續(xù)5代保持48 h的細胞密度是初始密度的兩倍以上，且細胞活率高于90%，可以認為馴化成功。待細胞在含2%胎牛血清的培養(yǎng)基中生長穩(wěn)定后，采用上述方法逐級降低培養(yǎng)基中血清用量(1%、0.5%胎牛血清含量)。降血清過程中細胞密度穩(wěn)定5代以上方可進行下一步降血清適應(yīng)。

1.2.2 懸浮細胞的批培養(yǎng)生長曲線繪制及代謝物含量測定 細胞密度測定方法采用臺盼藍(TB) 染色法，具體操作如下：取200 μL細胞懸液，用臺盼藍染液等體積稀釋細胞懸液后，吹打均勻，取20 μL加入細胞計數(shù)板中，放入Countstar 細胞計數(shù)器中計數(shù)，每個樣品取4個視野計數(shù)，結(jié)果求平均值，計算細胞密度。

將懸浮細胞按1×106/mL的初始密度接種40 mL培養(yǎng)基后置于125 mL三角搖瓶中，110 r/min、37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。在傳代后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h分別測定細胞密度并繪制生長曲線。在計數(shù)期間，同時每24 h取1 mL細胞懸液，3000 r/min離心10 min，吸取培養(yǎng)基上清液，使用NOVA 400多通道生化分析儀測定葡萄糖、乳酸、NH4+、谷氨酰胺的含量。

1.2.3 倍增時間的測定 取馴化傳代穩(wěn)定的細胞，每天取樣計數(shù)，繪制細胞生長曲線，計算細胞倍增時間。取馴化傳代穩(wěn)定細胞峰值前一天的細胞計數(shù)(Y)、接種細胞數(shù)(X)及生長時間(T)計算細胞倍增時間Δt，計算公式為:Δt=T/A；A= log2Y/X

1.2.4 細胞傳代穩(wěn)定性測定 將處于對數(shù)生長期的懸浮MDBK細胞按1×106/mL的初始密度接種40 mL培養(yǎng)基后，置于125 mL三角搖瓶中，110 r/min、37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。每48 h傳代一次，即用新鮮培養(yǎng)基將細胞液稀釋至1×106/mL。將細胞進行22 d的連續(xù)傳代培養(yǎng)，對比每次傳代時的細胞密度和細胞活率的差異。

1.2.5 病毒增殖實驗 取低血清培養(yǎng)基中生長良好的懸浮MDBK細胞，離心后按2×106/mL細胞密度接種至三角搖瓶，每瓶40 mL細胞懸液。同時按體積比的1%分別接入偽狂犬病毒和傳染性牛鼻氣管炎病毒。培養(yǎng)24 h、48 h、72 h分別收獲病毒并測定病毒滴度，同時設(shè)陰性對照和貼壁細胞接毒對照。

用DMEM無血清培養(yǎng)基將待檢病毒液在滅菌管作1∶10系列稀釋，取10-4～10-74個稀釋度病毒液，分別接種已在96孔板中生長良好的檢驗用細胞(貼壁生長的MDBK細胞)，每個稀釋度6個孔，100 μL/孔，同時設(shè)正常細胞對照。37 ℃、5% CO2條件下靜置培養(yǎng)96 h，按Reed-Muench法計算TCID50。

2 結(jié)果與分析

2.1 貼壁MDBK細胞在低血清培養(yǎng)基中懸浮馴化培養(yǎng) 結(jié)果見表1。MDBK細胞在貼壁狀態(tài)至2%血清全懸浮階段時，細胞容易受到血清的影響從而發(fā)生結(jié)團現(xiàn)象。采用細胞沉降的辦法，自然沉降2～4 min后盡可能吸取上層細胞懸液，轉(zhuǎn)移到等體積的新鮮培養(yǎng)基中。經(jīng)過8代左右，MDBK細胞逐漸可以適應(yīng)2%血清的全懸浮培養(yǎng)。再連續(xù)傳7代，保證每代在48 h的細胞密度是初始密度的兩倍，細胞活率穩(wěn)定在90%以上，可以認為細胞已經(jīng)初步適應(yīng)了懸浮培養(yǎng)條件。

表1 貼壁MDBK細胞全懸浮馴化情況Tab 1 Acclimation of adherent MDBK cells in complete suspension

隨著細胞對低血清的逐步適應(yīng)，進一步降低血清可以有效改善細胞的結(jié)團問題(圖1)，同時顯著提高了生長能力，即在0.5%血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d細胞密度最高可達1.16×107/mL。經(jīng)過35代左右的馴化，得到了一株可以在0.5%血清培養(yǎng)基中全懸浮生長的形態(tài)均一、分散均勻、生長密度穩(wěn)定的MDBK細胞(以下稱MDBK-0.5%FBS細胞)。

A:貼壁MDBK細胞形態(tài)；B:MDBK細胞在2%血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)72 h形態(tài)；C:MDBK細胞在1%血清懸浮培養(yǎng)72 h形態(tài)；D:MDBK細胞在0.5%血清懸浮培養(yǎng)72 h形態(tài)A:Morphology of adherent MDBK cells; B: MDBK cells cultured in 2% serum medium for 72 h; C: MDBK cells cultured in 1% serum medium for 72 h; D: MDBK cells cultured in 0.5% serum medium for 72 h圖1 MDBK細胞在不同血清濃度培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)狀態(tài)Fig 1 Suspension culture of MDBK cells in different serum concentrations mediums

2.2 在不同血清濃度中馴化的MDBK細胞的批生長曲線與倍增時間測定結(jié)果 在不同血清濃度中馴化的MDBK細胞在有限營養(yǎng)環(huán)境中批培養(yǎng)情況存在明顯差異(圖2)。在2%血清中懸浮適應(yīng)的MDBK細胞培養(yǎng)5 d時最大細胞密度達到7.08×106/mL，倍增時間為32.33 h；在1%血清中懸浮適應(yīng)的MDBK細胞5 d時最大細胞密度達到7.64×106/mL，倍增時間為30.15 h；在0.5%血清中懸浮適應(yīng)的MDBK細胞3 d時最大細胞密度達到11.6×106/mL，倍增時間為17.32 h。

2.3 MDBK-0.5%FBS細胞批培養(yǎng)過程中代謝物的含量變化 為考察MDBK-0.5%FBS細胞在有限營養(yǎng)環(huán)境中的代謝物變化情況，取處于對數(shù)生長期的細胞以1×106/mL初始密度進行為期 6 d的批培養(yǎng)實驗，定時檢測培養(yǎng)基中葡萄糖、乳酸、NH4+、谷氨酰胺的含量變化(圖2、圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，初始的1～2 d細胞處于對數(shù)生長期快速增長，同時葡萄糖作為重要的碳來源被快速消耗；第3天后，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖量快消耗殆盡，同時產(chǎn)生大量的NH4+、乳酸等副代謝產(chǎn)物時，細胞停止增殖，生長密度達到了最大值。

2.4 MDBK-0.5% FBS細胞的傳代穩(wěn)定性測定為研究MDBK-0.5% FBS懸浮細胞的傳代穩(wěn)定性，取處于對數(shù)生長期的懸浮MDBK細胞以1×106/mL的初始密度連續(xù)傳代，在多次傳代過程中，各個代次的細胞密度均維持在穩(wěn)定水平(48 h后細胞密度≥5×106/mL)，細胞活率保持在93%以上(圖4)。

圖2 不同血清濃度培養(yǎng)基中MDBK細胞懸浮生長的批生長曲線Fig 2 Batch growth curve of MDBK cells in different serum concentrations mediums

圖3 MDBK-0.5%FBS細胞批培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基葡萄糖、乳酸、NH4+、谷氨酰胺的含量變化Fig 3 Changes of glucose, lactic acid, NH4+, glutamine in MDBK-0.5%FBS batch culture

圖4 MDBK細胞在0.5%血清懸浮培養(yǎng)基中傳代密度以及細胞活率Fig 4 Passage density and cell viability of MDBK cells in 0.5% serum suspension medium

2.5 MDBK-0.5%FBS細胞對偽狂犬病毒和傳染性牛鼻氣管炎病毒的敏感性測定 MDBK-0.5%FBS細胞分別接種偽狂犬病毒和傳染性牛鼻氣管炎病毒后，24 h均發(fā)生了皺縮，72 h大部分細胞死亡。傳染性牛鼻氣管炎病毒滴度在24 h達到最高，為107.6TCID50/mL；偽狂犬病毒滴度在48 h達到最高，為107.6TCID50/mL(表2)。兩種病毒分別接種貼壁對照細胞后每24 h觀察一次，傳染性牛鼻氣管炎病毒接毒后24 h開始出現(xiàn)病變，48 h全部脫落；偽狂犬病毒接毒后24 h開始出現(xiàn)病變，72 h全部脫落。

表2 MDBK-0.5%FBS細胞增殖傳染性牛鼻氣管炎病毒和偽狂犬病毒結(jié)果Tab 2 Result of infectious IBRV and PRV in MDBK-0.5% FBS cells

3 討論與結(jié)論

利用全懸浮的細胞系作為疫苗的生產(chǎn)基質(zhì)，不僅可以實現(xiàn)在疫病爆發(fā)初期短時間內(nèi)大規(guī)模應(yīng)急生產(chǎn)的需要，還盡可能規(guī)避了大量使用動物源性血清所帶來不確定性外源因子的風(fēng)險[9]。

細胞的懸浮馴化關(guān)鍵點在于懸浮培養(yǎng)基種類以及馴化過程中策略的選擇。低血清或無血清懸浮培養(yǎng)基中通常使用酵母水解物配合成分明確的動物源生長因子來代替動物源性血清的營養(yǎng)作用[10]。糖類是細胞利用的重要能量和碳源，也是維持細胞生長重要能量供給。谷氨酰胺作為培養(yǎng)基添加劑可以有效地促進細胞生長和抗體的產(chǎn)生[11]。針對不同細胞的營養(yǎng)代謝特性選擇合適的培養(yǎng)基顯得尤為重要[12]。理想的懸浮培養(yǎng)基，可以使細胞有效利用葡萄糖，支持細胞的快速增長，同時延遲乳酸以及NH4+等副產(chǎn)物的積累，從而達到細胞高密度培養(yǎng)的目標。反之會使細胞在培養(yǎng)過程中對培養(yǎng)基中的糖類物質(zhì)利用率偏低，使乳酸、NH4+等代謝副產(chǎn)物的量快速積累，細胞過早地進入生長維持期，同時產(chǎn)生大量的細胞結(jié)團現(xiàn)象，無法實現(xiàn)細胞的高密度培養(yǎng)。

在細胞的懸浮馴化過程中一般采用將消化的細胞直接接入低血清/無血清懸浮培養(yǎng)基馴化，或者在貼壁或懸浮狀態(tài)下逐級替換原有培養(yǎng)基并降低血清的懸浮馴化方法[13]。逐級替代培養(yǎng)基降低血清的方法要比直接馴化法耗時多，但是相對柔和，適用于難以直接馴化的細胞。本實驗中MDBK細胞的懸浮馴化結(jié)合上述兩種方法，采用在低血清懸浮培養(yǎng)基中直接馴化，然后再逐級降低血清的策略，成功得到了一株可在0.5%血清濃度下懸浮生長，傳代穩(wěn)定性好，可在三角搖瓶中實現(xiàn)較高密度生長，最高密度可達1.16×107/mL的懸浮細胞。病毒敏感性實驗表明，雖然MDBK的培養(yǎng)方式發(fā)生了改變，但并沒有影響細胞對特定病毒的增殖特性。