解淀粉芽胞桿菌固態發酵當歸培養基的研究

朱慶賀，苗 艷，蘭世捷，陳 亮，尹珺伊，黃寶銀，田秋豐，張 紅，史同瑞

(黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院，黑龍江齊齊哈爾 161000)

當歸是一種具有補血活血、潤腸通便、調經止痛等功效的常用中草藥[1]。其主要活性成分為藁本內酯、阿魏酸和當歸多糖。在獸醫臨床中主要用于治療豬、牛、羊的卵巢囊腫和子宮內膜炎，效果顯著，也常作為中草料飼料添加劑用于改善動物生產繁殖性能[2-4]。然而，當歸中雖然含有眾多的藥物活性成分，但存在利用率較低的缺點，尤其在普通方法中藥提取后所剩藥渣中仍有較多活性成分殘留。因此，有必要進一步改進當歸相關活性成分的利用效率，提高活性物質的有效釋放。

微生物發酵已被廣泛報道可以有效提高中草藥中主要活性成分的含量，甚至能夠在發酵過程中產生新的活性物質[5-6]，這對于研究和開發新型綠色無公害飼料添加劑，新型中藥的進一步開發甚至作為抗生素的替代品具有重要意義。解淀粉芽孢桿菌是一種好氧、易分離培養、抗逆性強的益生菌，可以提高飼料利用率，改善動物腸道微生物菌群結構。此外，解淀粉芽孢桿菌能夠分泌多種酶類物質和抑菌活性物質，運用在中藥發酵中能夠幫助裂解細胞壁，從而有利于中藥有效成分的釋放[7-8]，研究利用已分離的一株解淀粉芽孢桿菌進行當歸發酵，并以當歸多糖含量為指標對固態發酵當歸培養基的成分進行了篩選和優化，確定了固態發酵培養基的主要成分及添加比例。為后期獸用當歸發酵產品的技術開發及工業生產應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 解淀粉芽孢桿菌SSYB株，由本單位微生物研究室分離并保存)；當歸粉(過40目篩)，購自齊齊哈爾齊泰醫藥；蛋白胨，購自北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖、蔗糖、尿素等，購自齊齊哈爾恒輝化工。

1.2 試驗儀器 UV-1900 PC/UV-1901雙束紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；TGL-16C臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；MS104TS/02電子天平，梅特勒-托利多(上海) 有限公司。

1.3 種子液的制備 將貯存于-80 ℃的解淀粉芽孢桿菌(SSYB)解凍后劃線于營養瓊脂平板上，過夜培養后，從平板中挑取單菌落至5 mL營養肉湯培養基中，37 ℃，170 rpm搖床活化16～18 h后，即制得種子液。

1.4 當歸固態發酵培養基成分的篩選

1.4.1 碳源篩選 分別以50 g/L玉米粉、50 g/L馬鈴薯淀粉、10 g/L蔗糖、100 g/L當歸替代基礎培養基(基礎培養基：蛋白胨20 g/L、葡萄糖10 g/L、NaCL 5 g/L、當歸粉100 g/L)中的碳源葡萄糖，培養基中其他成分不變。取解淀粉芽胞桿菌種子液，以2%接種量分別接種替代培養基，同時以基礎培養基作為對照。均置于37 ℃靜止培養72 h，取樣，按苯酚-硫酸顯色法測定多糖質量分數，每個處理重復3次。

1.4.2 氮源篩選 分別以10 g/L 尿素、50 g/ L 黃豆粉、10 g/L (NH4)2SO4和10 g/L NHCl 替代基礎培養基中的氮源蛋白胨，培養基中其他成分不變。按照1.4.1中的方法培養、取樣和測定多糖質量分數，每個處理重復3次。

1.4.3 無機鹽篩選 分別以2 g/L KH2PO4、1.5 g/L碳酸鈣、2 g/L 硫酸鎂(MgSO4·7H2O)和0.2 g/L硫酸錳替代基礎培養基中的NaCl，培養基中其他成分不變。按照1.4.1中的方法培養、取樣和測定多糖質量分數，每個處理重復3次。

1.5 當歸發酵培養基的優化

1.5.1 試驗設計及結果分析 通過單因素試驗篩選出當歸粉、黃豆粉、碳酸鈣和水為當歸固態發酵培養基的組成成分，采用響應面中心組合的方法設計四因素三水平的響應面分析試驗，優化當歸固態發酵培養基中當歸粉、黃豆粉、碳酸鈣和水4個組分的配比量。各因素水平及編碼見表1，試驗設計方案見表2。用軟件Design Expert V 12進行試驗設計及數據分析，每個試驗設置3組平行試驗。

1.5.2 模型驗證試驗 將根據數據分析結果得到的最優化培養基和原始培養基，在相同的條件下進行發酵培養，按1.4.1中的方法培養、取樣和測定多糖質量分數，以驗證預測結果的準確，每個試驗設置3組平行試驗。

表1 Box-Behnken Design試驗因素和編碼水平Tab 1 Factors and levels for Box-Behnken Design

1.6 固體發酵當歸中多糖含量的測定

1.6.1 標準曲線的繪制 選用苯酚-硫酸法進行測定。精密稱取在105 ℃干燥至恒重的葡萄糖對照品0.1 g于100 mL的容量瓶中，加水定容至100 mL即得1 mg/mL葡萄糖對照品溶液，取1 mg/mL葡萄糖對照品分別制備為5、10、20、40、60、80、100 μg/mL葡萄糖對照品溶液。分別吸取2 mL，加5%的苯酚1 mL，混勻后迅速加5 mL濃硫酸，混勻后沸水中加熱15 min，放置室溫后測量，以蒸餾水為空白，490 nm測定吸光度值。

1.6.2 樣品溶液的測定 取5 g固態發酵培養物加100 mL水震蕩浸泡1 h，離心取上清后加無水乙醇至乙醇終濃度為75%，室溫靜置24 h后離心收集沉淀加水定容至500 mL，按照1.6.1中苯酚-硫酸法進行測定。

2 結果與分析

2.1 培養基成分的篩選

2.1.1 碳源篩選 試驗結果如圖1-A所示，以當歸為碳源的培養基中每克發酵物中多糖質量分數最高(24.69 mg/g)，然后依次是葡萄糖(23.08 mg/g)、玉米粉(23.05 mg/g)、馬鈴薯淀粉(22.86 mg/g)，蔗糖(22.56 mg/g)。因以當歸粉為碳源進行發酵所得多糖含量最高，且本研究菌株旨在用于發酵中藥，所以選用當歸粉為碳源。

2.1.2 氮源篩選 試驗結果如圖1-B所示，以黃豆粉為氮源的培養基中每克發酵物中多糖質量分數最高(24.75 mg/g)，然后依次是蛋白胨(24.45 mg/g)、尿素(22.87 mg/g)、NH4Cl (22.50 m/g)、(NH4)2SO4(22.15 mg/g)，所以選用黃豆粉為氮源。

2.1.3 無機鹽篩選 試驗結果如圖1-C所示，以碳酸鈣為無機鹽的培養基中每克發酵物中多糖質量分數最高 (24.88 mg/g)，然后依次是氯化鈉(24.76 mg/g)、硫酸鎂 (24.43 mg/g)、硫酸猛(24.21 mg/g)，KH2PO4最低(24.04 mg/g)，所以選用碳酸鈣為無機鹽。

圖1 培養基成分篩選Fig 1 Screening of medium components

2.2 當歸發酵培養基的優化

2.2.1 試驗設計及結果 在單因素的試驗基礎上，采用Box-Behnken Design方法設計四因素三水平的響應面分析試驗，以多糖含量為響應值，以當歸(A)、黃豆粉(B)、碳酸鈣(C)和水(D)為四個考察因素進行響應面分析，試驗設計及結果見表2，共計29組試驗，其中Y為每克固態發酵培養物中當歸多糖的提取量(mg)。

表2 Box-Behnken Design試驗設計及結果Tab 2 Protocol and result of Box-Behnken Design

2.2.2 數據處理 由表3可知，使用軟件Design Expert V 12對上表中的試驗結果進行分析，得回歸方程：Y=24.5+1.18*A+0.7192*B-0.1283*C-0.1058*D+0.2400*AB+0.3300*AC-0.0750*AD+0.2650*BC+0.1375*BD-0.1900*CD-1.58*A2-0.8348*B2-1.18*C2-0.6948*D2。其中，R2=0.9475，說明該模型與實際擬合較好，A2、B2、C2、D2對Y值影響均極顯著(P<0.001)，其余項影響均不顯著。

2.2.3 響應面分析 由圖2、3可知，通過Design Expert V 12軟件作響應面圖及等高線圖，可直觀地看出各因子對響應值的影響變化趨勢。其中，圖1中A、B兩因素在所設中心點附近取值時Y值達到最大，圖2中C、D兩因素在所設中心點附近取值時Y值達到最大。在本研究水平范圍內Y存在最大值，即等高線圖標記的中心點。當Y 值最大時，四個考察因素的濃度通過所得回歸方程可求解，即：當歸320.914 g/L、黃豆粉109.918 g/L、碳酸鈣1.532 g/L、水544.159 mL/L。

圖2 當歸粉與黃豆粉交互響應面圖及其等高線圖Fig 2 Response surface and contour plots for the effect between angelica and soybean flour

圖3 碳酸鈣與水交互響應面圖及其等高線圖Fig 3 Response surface and contour plots for the effect between calcium carbonate and water

2.2.4 模型驗證試驗 進行三次重復固態發酵后，固態發酵物中的當歸多糖質量分數分別為24.88、24.91和 24.81 mg/g，平均值為24.87 mg/g，與預測值相符。

2.3 固體發酵當歸中多糖含量的測定

2.3.1 標準曲線的繪制 由圖4可知，以490 nm為檢測波長，測定各稀釋度的葡萄糖對照品吸光度，以葡萄糖濃度(μg/mL)為x軸，吸光值為 y軸進行回歸分析，得回歸方程：y=0.0134x-0.0417，R2=0.9956。結果表明，在 5 μg/mL～100 μg/mL質量濃度范圍內，吸光度與濃度呈良好的線性關系。

圖4 葡萄糖標準曲線Fig 4 Glucose standard curve

2.3.2 樣品溶液的測定 按照1.6.1中苯酚-硫酸法對樣品進行吸光度測定，然后通過所繪制標準曲線的回歸方程求得所測樣品中葡萄糖濃度，結果見表2，其中的Y值即為每克固態發酵培養物中當歸多糖的提取量(mg)。

3 討論與結論

解淀粉芽孢桿菌具有較強的產酶特性，可以合成多種纖維素酶，具有促進木質纖維素分解的能力[10]。纖維素酶能夠促進多種中藥中有效成分釋放，從而提高中藥的提取率[7]。侯美如等利用解淀粉芽胞桿菌對中藥黃芪進行固態發酵，結果顯示，利用解淀粉芽胞桿菌固態發酵黃芪可顯著提高黃芪各種有效成分的含量。從而提高了黃芪的利用率[9]。研究應用本研究室所分離篩選到的一株產纖維素酶解淀粉芽胞桿菌(SSYB)發酵當歸，旨在為研發當歸發酵中藥奠定技術基礎。

表3 二次回歸模型方差分析結果Tab 3 ANOVA results of factors for the quadratic regression model

當歸的主要活性成分為當歸多糖，一般采用粗提、精提等多種分離技術，主要形式包括利用熱水浸提法、微波萃取技術法、超聲萃取法以及水煮醇沉法等進行提取[1]，本研究根據得量對比以及技術條件要求選擇超聲法進行了當歸多糖的提取，結果表明，無論發酵前或是發酵后都能有效提取當歸多糖，而且在經過篩選和優化后，發酵后的當歸多糖得量質量分數達到24.91 mg/g，即發酵后的當歸多糖含量達到了發酵前當歸多糖的149.70%。發酵后當歸多糖增加了接近50%。證明解密芽孢桿菌發酵能夠顯著增當歸中有效物質當歸多糖的含量。

另外，目前用于發酵當歸的菌種主要是靈芝菌，魏龍以當歸為藥性基質，靈芝為發酵菌種進行了雙向發酵，確定靈芝-當歸雙向發酵菌質具有良好的抗氧化活性，且較發酵前具有顯著提高[5]，但該發酵方式時間較長，對pH和料層厚度都有一定要求，這就大大增加了時間成本、勞動成本和發酵難度。目前報道有將解淀粉芽胞桿菌用于中藥黃芪發酵的報道，但尚未有用于當歸發酵的報道。本研究選用在實際產業化生產中可實現的條件對當歸進行發酵，所用培養基組分常見，所用發酵條件和方法簡單易操作，更易于實現產業化，有廣闊的應用前景。

研究根據解淀粉芽胞桿菌分離株的生物學特性以及研發目的，以當歸粉、玉米粉、黃豆粉、尿素、碳酸鈣、氯化鈉等原材料為對象，采用單因素試驗篩選擬用于當歸產業化固態發酵的培養基組分，結果表明，當歸粉、黃豆粉、碳酸鈣和水是有利于當歸發酵的高效成分。采用Box-Behnken Design試驗優化的固態發酵培養基成分為當歸320.914 g/L、黃豆粉109.918 g/L、碳酸鈣1.532 g/L、水544.159 mL/L，表明在上述成分比例條件下，當歸能夠被最優發酵。