實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應在高危型人乳頭瘤病毒診斷中的應用價值

黃曉葉

宜賓市第一人民醫(yī)院檢驗科 (四川宜賓 644000)

人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)是一種DNA病毒，臨床已明確，其是引發(fā)宮頸癌的主要因素，且多數(shù)宮頸病變均伴有HPV感染。在宮頸癌標本中，90%以上均可檢出HPV-DNA，因此，做好HPV臨床檢查工作，可促進宮頸癌預防及治療工作的開展[1]。臨床主要通過形態(tài)學法檢查HPV，但上述方法靈敏度及特異度較低，假陽性率較高，易出現(xiàn)誤診情況。近年來，隨著基因技術(shù)的發(fā)展，實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)檢查技術(shù)越發(fā)成熟，其對高危型HPV更加靈敏，對臨床診斷宮頸病變具有指導意義，但該項技術(shù)現(xiàn)今仍處于研究階段。鑒于此，本研究探討實時PCR在高危型HPV診斷中的應用價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年8月至2020年3月在我院婦科門診行宮頸薄層液基細胞學檢查異常的105例患者作為研究對象，年齡28～63歲，平均(51.52±3.65)歲；體重52～75 kg，平均(62.52±3.15)kg。本研究通過醫(yī)學倫理委員會審核批準。納入標準：均存在白帶增多和(或)帶有血絲、接觸性出血等癥狀；陰道鏡檢查顯示子宮頸存在充血、肥大及糜爛等癥狀；患者對本研究知情并簽署知情同意書。排除標準：處于妊娠期、哺乳期及月經(jīng)期的女性；進行HPV治療的患者；合并生殖系統(tǒng)病史的患者；合并重要器官、系統(tǒng)功能障礙的患者。

1.2 方法

標本收集：患者取截石位，取樣前使用無菌棉簽去除宮頸口分泌物，然后將美國Digene公司生產(chǎn)的采樣刷置入宮頸內(nèi)1～2 cm處，順時針方向旋轉(zhuǎn)5～8周，停留5 s后取出。

實時PCR：將標本放于裝有1 ml 0.9%氯化鈉注射液的離心管中，以13 000 r/min離心10 min，棄上層清液，后加入50 μl裂解液進行懸浮和沉淀，于100 ℃下加熱10 min左右，再次以13 000 r/min離心10 min，取上層清液待用；將上層清液于50 ℃下加熱15 min，再次于90 ℃下加熱10 min，循環(huán)40次，直至加熱模板DNA到95 ℃，雙鏈DNA解離為單鏈DNA；將PCR產(chǎn)物放入雜交緩沖液中進行沸水浴變性，時間為10 min左右，后于51 ℃雜交1 h后于同溫度下洗脫15 min；使用植物過氧化物酶(peroxidase，POD)進行孵育和洗滌，并配置顯色液，顯色后使用美國應用生物系統(tǒng)有限公司的ABI 7500 Resl Time PCR System熒光定量PCR儀進行分析，高危型HPV檢測盒購于凱普生物公司。

第二代雜交捕獲技術(shù)(hybrid capture-Ⅱ，HC-Ⅱ)：將標本保存于美國Hologic的Preservcyt細胞保存液中，并采用ThinPrep法制作液基細胞學薄片，標本檢測均采用美國Digenne公司生產(chǎn)的HPV-DNA試劑盒和HC-Ⅱ基因雜交信號放大檢測系統(tǒng)，所有涂片均按《TBS子宮頸細胞學報告系統(tǒng)回顧及新版解讀》[2]中的診斷標準進行診斷。

組織病理：使用湖南恒星科技股份有限公司的WH-SMA型電子陰道鏡對宮頸內(nèi)可疑病灶進行定位，取出部分組織進行病理檢查；若無可疑病灶，于宮頸管口，通過多點取材后送檢，結(jié)果由兩名經(jīng)驗較為豐富的醫(yī)師進行診斷。

1.3 臨床評價

以組織病理結(jié)果為金標準，比較實時PCR與HC-Ⅱ檢查高危型HPV的陽性率。HPV檢出標準：組織病理結(jié)果為宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅰ級及以上；實時PCR檢查結(jié)果中RLU/CO>1；HC-Ⅱ檢查結(jié)果中HPV的負荷量≥1.0 pg/ml[3]。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗；一致性分析采用Kappa檢驗，Kappa>0.75表明一致性極好，0.40～0.75表明一致性較為理想，<0.40表明一致性差。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 組織病理檢查結(jié)果

經(jīng)組織病理檢查結(jié)果顯示，105例患者中，炎癥反應42例，CINⅠ級35例，CINⅡ級18例，CINⅢ級7例，宮頸鱗狀細胞癌3例。

2.2 兩種方式檢查高危型HPV的陽性率比較

實時PCR檢查高危型HPV與組織病理檢查結(jié)果具有極好的一致性(Kappa=0.771)；HC-Ⅱ檢查高危型HPV與組織病理檢查結(jié)果具有較為理想的一致性(Kappa=0.546)，見表1～2。實時PCR檢查高危型HPV的陽性率為87.30%(55/63)，高于HC-Ⅱ檢查的55.56%(35/63)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表1 實時PCR與組織病理檢查高危型HPV的結(jié)果比較(例)

表2 HC-Ⅱ與組織病理檢查高危型HPV的結(jié)果比較(例)

表3 兩種方式與組織病理檢查結(jié)果比較(例)

3 討論

目前，臨床已發(fā)現(xiàn)的HPV基因型有100種左右，不同分型的病毒致病能力不同，高危型病毒的致病能力較強，且具有較高的致癌能力，因此，做好高危型HPV的檢查工作，對感染患者的臨床干預和治療具有非常重要的意義[4]。

HC-Ⅱ是將第一代試管法改為了96孔平板法，提高了整體工作效率，更有利于篩查，但其存在局限性：(1)該種檢測方式的標本收集及保存均有一定特殊要求；(2)若檢測中所得相對光的單位值<1.0，則無法確定是否發(fā)生HPV感染；(3)檢測過程中易存在交叉感染，假陽性較高[5]?？傊?，該種檢測方式的結(jié)果仍有一定不確定性，還需尋找其他方式提高高危型HPV陽性檢出率。實時PCR技術(shù)的原理是將標本的DNA和有熒光素探針進行混合，完成高溫變性、低溫復性及通過適溫延伸的熱循環(huán)后，將標本模板DNA互補配對的探針切斷，探針上的熒光素隨之在反應體系中游離，并于特定光下發(fā)出不同熒光，且經(jīng)循環(huán)次數(shù)增加和不斷擴增后，通過確定熒光強度，得到Ct值，再與標準進行有效對照，從而得到患者標本的目的基因拷貝數(shù)[6-7]。本研究結(jié)果顯示，實時PCR檢查高危型HPV與組織病理檢查結(jié)果具有極好的一致性(Kappa=0.771)；實時PCR檢查高危型HPV的陽性率高于HC-Ⅱ檢查，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

綜上所述，實時PCR可提高高危型HPV的陽性檢出率，為臨床早期制定干預和治療宮頸病變措施提供一定依據(jù)。