三物白散通過影響FXR表達逆轉Th1/Th2漂移發(fā)揮抗肝癌免疫應答作用*

李素素，濮文淵，凌云，馬俊杰，孫松嫻，張靜遠，周春祥

南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210046

肝癌是世界公認的惡性疾病，是全球癌癥死亡的第三大原因[1]，其死亡率居我國消化道惡性腫瘤死亡率之首[2]。中醫(yī)無“肝癌”病名，但“鼓脹”“癥瘕”“肝積”等與其相似。近年來研究發(fā)現(xiàn)[3]，肝癌的發(fā)生發(fā)展和腸道菌群的失調(diào)密切相關。中醫(yī)藥可改變腸道微生態(tài)環(huán)境，調(diào)節(jié)腸道菌群和膽汁酸的異常代謝，進而提高機體的免疫力，促進抗腫瘤免疫過程[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，三物白散可升高肝癌皮下種植瘤小鼠血清中白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、降低白細胞介素-4(interleukin-4，IL-4)水平，逆轉Th1/Th2漂移，改善免疫抑制狀態(tài)，實現(xiàn)肝癌免疫的正向調(diào)節(jié)作用[5]。三物白散最早見于《傷寒論》，是溫下通腑法的經(jīng)典方劑，方中巴豆通利二便，可顯著改善腸道菌群結構[6]，影響腸道免疫和微生物環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，而法尼醇X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)是保持腸道免疫和穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子，F(xiàn)XR的表達和肝癌的發(fā)生率有一定相關性，F(xiàn)XR可抑制IL-2、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和干擾素-γ(interferon-gamma，IFN-γ)等Th1細胞因子的mRNA的表達[7-8]。腸道菌群的變化可引起膽汁酸代謝的改變，膽汁酸循環(huán)入肝，用抗生素和膽汁酸贅合物-消膽胺干預肝癌小鼠，可引起Th1細胞因子對肝癌免疫應答的正向調(diào)控[9-10]。三物白散逆轉Th1/Th2漂移實現(xiàn)抗肝癌免疫的機制可能與FXR的表達、腸道菌群及膽汁酸代謝等因素有關。為證實此推測，本研究用三物白散、抗生素和消膽胺作為干預藥物，觀察各組肝癌小鼠血清及肝臟中Th1/Th2、腸道菌群、回腸中FXR表達，以期深入探討三物白散抗肝癌的機制。

1 材料

1.1 動物及細胞雄性SPF級4周齡ICR小鼠46只，體質量18～22 g，購于南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，動物許可證號：SCXK(蘇)2017-0001，合格證號：201920801，倫理批號：201906A035。小鼠肝癌細胞H22細胞(南京拜睿生物科技有限公司，貨號：BR0661)。

1.2 藥物及試劑三物白散(由巴豆、桔梗、貝母三味藥組成，安徽藥信藥業(yè)有限公司，批號：20180908)；消膽胺(南京厚生藥業(yè)有限公司，批號：190301)；注射用鹽酸萬古霉素(浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，批號：612D021)。磷酸緩沖液(美國HyClone公司，批號：AE26543276)；胎牛血清(杭州四季青公司，批號：11012-8611)；青鏈霉素混合液(索萊寶公司，批號：20190523)；DMEM高糖培養(yǎng)液(美國HyClone公司，批號：AE29163474)；蘇木精-伊紅(HE) 染液(廣州鴻泉生物科技有限公司，批號：HQ6001)；TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10 ELISA試劑盒(南京金益柏生物科技有限公司，批號分別為：JEB-12474、JEB-12796、JEB-12265、JEB-12266、JEB-12260)；Real time PCR Master Mix(SYBR Green)(瑞士Roche 公司，批號：04913850001)；TRIzol RNA試劑(Thermo Fisher scientific公司，批號：10296028)；EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(全式金公司，批號：AE301-03)；AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix(諾維贊公司，批號：Q511-02/03)；PCR定量試劑盒(美國 Invitrogen 公司，批號：P7589)；瓊脂糖(美國 Invitrogen 公司，批號：75510-019)；Osteopontin抗體(美國Abcam，貨號：ab214050)；β-actin抗體(康為世紀公司，貨號：CW0097)；ECL發(fā)光試劑盒(美國CST公司，批號：6883S)。

1.3 儀器Sorvall ST 16R型高速離心機(美國賽默飛公司)；熒光顯微鏡(日本尼康)；RM2245型石蠟切片機、HI1220型烘片機、HI1210型攤片機、ASP200s型脫水機、EG1150型包埋機(德國Leica公司)；BS224型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；DW-86L626型-86 ℃超低溫保存箱(海爾醫(yī)學生物儀器公司)；Lightcycle 96 realtime-PCR檢測儀(羅氏公司)；TaKaRa Thermal Cycler PCR儀(TaKaRa公司)；Nano-100微量檢測儀(杭州奧盛公司)；Ion S5TMXL測序系統(tǒng)(美國Thermo Fisher Scientific公司)；超微量分光光度(美國Thermo Fisher Scientific公司)DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)；印跡轉膜系統(tǒng)(北京六一儀器廠)。

2 方法

2.1 藥物制備三物白散：將巴豆仁打成細粉，取適量巴豆粉置于1 L圓底燒瓶內(nèi)，加入2倍的巴豆粉體積的石油醚，輕微搖晃使巴豆與石油醚充分混合，采取回流提取法在70 ℃恒溫加熱約2 h后收集上層溶液，經(jīng)紗布過濾后使用旋轉蒸發(fā)儀分離石油醚和巴豆油，收集巴豆油，如此反復加入石油醚提取2次。將經(jīng)石油醚煎煮后的巴豆渣倒出，平鋪于瓷盤內(nèi)的紗布上，置于通風櫥待石油醚揮發(fā)殆盡后，轉置于50 ℃干燥箱中徹底烘干。取烘干后巴豆渣再次打粉，過60目網(wǎng)篩后備用，巴豆霜按比例與巴豆油充分混勻。將桔梗、浙貝母飲片分別粉碎，過60目網(wǎng)篩，分裝備用。參照《人和動物間按體表面積換算的等效劑量比值表》，將三物白散(成人)換算成小鼠給藥濃度，將巴豆霜、浙貝母、桔梗按比例配成三物白散，再加入超純水配制成三物白散混懸液，濃度為5.647 g·L-1，給藥劑量為56.47 mg·kg-1。萬古霉素：稱取萬古霉素藥粉，用超純水溶解，制備成濃度為0.5 g·L-1的溶液，置于4 ℃冰箱備用，給藥劑量為5 mg·kg-1。消膽胺飼料：消膽胺藥粉和小鼠飼料粗粉按2100的比例稱取，充分混勻，加適量 100 ℃ 開水攪拌均勻，手工捏成條狀，置于 50 ℃ 烘干箱烘干，備用，即為2%的消膽胺飼料。

2.2 細胞培養(yǎng)按照懸浮生長細胞的培養(yǎng)方式進行細胞復蘇和反復傳代，直到收集足夠數(shù)量的肝癌H22細胞。

2.3 造模分組及給藥取適應性喂養(yǎng)1周后的ICR小鼠40只，根據(jù)前期預實驗和文獻方法進行小鼠肝癌原位移植瘤造模[11]。將小鼠用1%的戊巴比妥納麻醉，取仰臥位，固定于鼠板，常規(guī)消毒，用組織剪沿腹中線逐層剪開皮膚，開口長度為 1 cm，暴露出肝臟。擠出肝臟左外葉，用無菌棉簽將肝葉上體液輕輕擦拭干凈，取生長良好的H22細胞，離心收集，顯微鏡下計數(shù)約16×107個，用磷酸緩沖液制備成5 mL的細胞混懸液。用1 mL注射器吸取 0.1 mL 細胞混懸液，細胞數(shù)約為4×106個，注射器針頭與肝左葉成20°左右的角度刺入肝葉內(nèi)約 5 mm 深，注意不要刺穿肝葉，輕輕推注射器，邊推邊退出針頭，可觀察到注射部位的肝葉顏色變灰白，待針頭完全退出時用無菌棉簽按壓針孔15 s左右，并滴入組織黏合劑封閉針孔，以防細胞液漏出，待組織粘合劑完全干燥變硬無黏性時縫合關腹，縫合針逐層縫合，無菌棉簽擦拭血漬，予以金霉素眼膏涂抹，預防切口感染，小心飼養(yǎng)。

分組：造模成功后隨機分為三物白散組、萬古霉素組、消膽胺組和模型組，每組10只，空白對照組為6只正常小鼠。三物白散組：正常飼料+飲用超純水+三物白散混懸液；抗生素組和消膽胺組給藥方法按照文獻進行[9]，萬古霉素組：正常飼料+飲用超純水+萬古霉素溶液；消膽胺組：2%消膽胺飼料+飲用超純水+生理鹽水；模型組和空白組：正常飼料+飲用超純水+生理鹽水。造模 24 h后按照上述方式飼養(yǎng)，連續(xù)給藥21 d。

2.4 腫瘤組織病理檢查連續(xù)給藥21 d后，統(tǒng)計小鼠存活數(shù)，計算各組小鼠的存活率。頸椎脫臼處死，解剖取肝臟，觀察肝臟長瘤情況，并檢查有無腫瘤組織塊脫落和腫瘤的轉移，稱其質量、拍照。將肝癌組織浸泡在4%多聚甲醛溶液中，2 d后用乙醇脫水，二甲苯透化，石蠟包埋，常規(guī)制備病理切片后，鏡下觀察肝癌組織的病理變化。

2.5 血清因子檢測眼眶取血，低溫(4 ℃)高速離心，取上清液，檢測各組小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-2，IL-4、IL-10水平。

2.6 肝組織IFN-γ水平取肝臟組織，制備肝勻漿，檢測其IFN-γ水平。

2.7 q-PCR法檢測回腸組織FXR的表達運用Trizol法提取RNA[12-13]，提取后檢測其純度。抽提后，稀釋RNA，并檢測其OD260·OD280-1的比值，比值為1.8～2.2，即為正常。本操作按照PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)說明書進行逆轉錄合成cDNA，應用實時熒光定量PCR儀測定FXR轉錄水平表達。PCR反應步驟如下：95 ℃變性10 min，40個循環(huán)：(95 ℃15 s，60 ℃ 34 s，72 ℃30 s)，收集熒光信號，反應結束，進行數(shù)據(jù)分析，用2-ΔΔCt計算FXR的表達。以GAPDH為內(nèi)參，引物序列見表1。引物由南京金益柏生物科技有限公司設計合成。

表1 引物序列

2.8 Westernblot法檢測小鼠回腸組織中FXR的表達小鼠的回腸組織用1 mL的RIPA緩沖液勻漿取上清，NanoDrop測定蛋白含量。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉移到 PVDF 膜上，用含5%脫脂奶粉 PBST封閉1 h；一抗4 ℃孵育過夜，PBST漂洗3次，每次5 min；二抗室溫孵育1 h，PBST漂洗3次，每次5 min；加入ECL發(fā)光液，在化學發(fā)光成像儀成像后進行灰度值分析。

2.9 腸道菌群的測序小鼠處死當天，收集回盲部腸道內(nèi)容物，置于凍存管中，-80 ℃超低溫冰箱備用。提取腸道菌群總DNA，用賽默飛公司的Ion S5TMXL上機測序。下機整理數(shù)據(jù)，完成測序數(shù)據(jù)生物信息學分析，進行腸道菌群豐度和多樣性分析。

3 結果

3.1 小鼠的死亡數(shù)量空白組小鼠未出現(xiàn)死亡和腹水；模型組小鼠有5只腹水，死亡4只；消膽胺組小鼠4只腹水，死亡2只；三物白散組小鼠1只腹水，無死亡；萬古霉素組小鼠2只腹水，無死亡。

3.2 小鼠肝癌組織的病理結果空白組為正常肝組織切片；模型組有大量炎癥浸潤性細胞，中心壞死并形成大量空洞；三物白散組僅有極少量的癌性炎癥細胞浸潤；萬古霉素組和消膽胺組有大量炎性浸潤的細胞，壞死性空洞較少。見圖1。

3.3 對小鼠血清Th1細胞因子的影響與空白組比較，模型組血清IL-2、TNF-α、IFN-γ的水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，三物白散組中 IL-2、TNF-α、IFN-γ水平顯著升高(P<0.01)，萬古霉素組IL-2水平顯著升高(P<0.01)，消膽胺組TNF-α水平顯著升高(P<0.01)。見表2。

注：A：空白組；B：模型組；C：三物白散組；D：萬古霉素組；E：消膽胺組

表2 對小鼠血清Th1細胞因子的影響

3.4 對小鼠血清Th2細胞因子(IL-4、IL-10)的影響與空白組比較，模型組血清IL-4水平明顯升高(P<0.05)，IL-10水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，三物白散、萬古霉素、消膽胺均可降低IL-4、IL-10的水平(P<0.05；P<0.01)；而三物白散和萬古霉素效果優(yōu)于消膽胺。見表3。

表3 對小鼠血清Th2細胞因子的影響

3.5 對小鼠肝臟組織IFN-γ水平的影響與空白組比較，模型組肝臟組織中IFN-γ水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，萬古霉素和三物白散組均可升高IFN-γ的水平(P<0.05；P<0.01)。見表4。

表4 對小鼠肝臟組織IFN-γ水平的影響

3.6 對小鼠回腸組織FXRmRNA表達的影響運用q-PCR法檢測各組小鼠回腸組織內(nèi)FXRmRNA的表達。與空白組比較，模型組小鼠回腸組織中FXRmRNA表達顯著增高(P<0.01)；與模型組比較，三物白散組和萬古霉素組FXRmRNA的表達降低(P<0.05)，消膽胺組FXRmRNA表達升高(P<0.01)。見表5。

表5 對小鼠回腸組織FXR mRNA表達的影響

3.7 Western Blot法測定小鼠回腸組織中FXR的表達與空白組相比，模型組小鼠回腸組織中FXR的表達顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，三物白散組和萬古霉素組FXR表達明顯降低(P<0.05)，消膽胺組FXR表達有降低的趨勢(P>0.05)。見表6和圖2。

注：K：空白組；M：模型組；S：三物白散組；W：萬古霉素組；X：消膽胺組

3.8 腸道菌群測序

3.8.1 各組小鼠腸道菌群豐度及多樣性分析與空白組比較，模型組菌群豐度(Chao1)指數(shù)降低、香農(nóng)(Shannon)指數(shù)增高(P<0.05)；與模型組比較，三物白散組腸道菌群Chao1、Shanno指數(shù)有降低的趨勢(P>0.05)，消膽胺組菌群Chao1、Shanno指數(shù)明顯增加(P<0.05)，萬古霉素組可明顯降低Chao1、Shanno指數(shù)(P<0.05)。見表7。

表6 小鼠回腸組織中FXR蛋白表達相對灰度值分析

表7 腸道菌群豐度和多樣性分析

3.8.2 用Bray Curtis距離計算差異度分析使用Bray Curtis距離計算差異度分析 Bray Curtis距離值在0～1之間，數(shù)值接近0時表示菌群組成和豐度一致，組間無差異或差異不顯著，數(shù)值越大表示組間樣品的差異越大。與空白組變焦，模型組菌群有差異，與模型組比較，三物白散差異不顯著，萬古霉素和消膽胺組差異明顯。見圖3。

3.8.3 小鼠腸道菌群在綱水平上的分布情況為進一步明確小鼠腸道菌群的物種組成，將OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫對比分析，發(fā)現(xiàn)主要為以下4種菌門構成：厚壁菌門(Firmicute)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)，其中大多數(shù)菌門都集中在厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門。在綱水平中，與空白組比較，模型組梭狀芽孢桿菌綱(Clostridia)豐度增加；與模型組比較，三物白散組梭狀芽孢桿菌和擬桿菌綱(Bacteroidia)豐度明顯減少(P<0.05)，萬古霉素組梭狀芽孢桿菌豐度明顯減少(P<0.05)，消膽胺組梭狀芽孢桿菌綱和擬桿菌綱豐度顯著增加(P<0.01)。見圖4。

注：GroupK：空白組，GroupM：模型組，GroupS：三物白散組，GroupW：萬古霉素組，GroupX：消膽胺組

注：Group1：模型組，Group2：三物白散組，Group3：萬古霉素組，Group4：消膽胺組，Group5：空白組

4 討論

《素問·陰陽應象大論》有“陽化氣陰成形”之論，陽主動、主散，化氣作用是陽的特性，陰主靜、主凝，成形是陰的特性。陽化氣陰成形是自然萬物生化及人體物質代謝的基本活動形式，自然界萬物的生化，人體生理活動的新陳代謝，都可概括為“陽化氣，陰成形”[14]。在病理上，形成腫瘤的本質原因是機體陽氣受損化氣不及而陰成形太過[15]。現(xiàn)代研究表明[16]，中醫(yī)藥可改變消化道腫瘤中腸道菌群結構，提高腫瘤患者免疫功能。三物白散原方由巴豆、桔梗、貝母三藥組成。巴豆性辛溫，可化寒凝之形，將有形之物推出體外，攻邪外出[17]。其可調(diào)整小腸傳輸功能紊亂，降低腸黏膜通透性，防止腸腔內(nèi)發(fā)生細菌或病毒移位，抑制腸道致病菌群生長[18-19]。桔梗中的桔梗皂苷具有抗腫瘤、保肝、抗病毒等藥理作用，且桔梗皂苷D、桔梗皂苷D3和遠志皂苷均可抑制人肝癌 Bel-7402細胞株的增殖，但口服絕對生物利用度低，很難被腸道直接吸收，因而可能作為一種益生元，增加有益菌的數(shù)量和比例，通過改善腸道內(nèi)環(huán)境，平衡紊亂的菌群，促進機體康復[20-21]。目前已經(jīng)證實[22]，三物白散體外可殺傷腫瘤細胞、調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖周期進而促進腫瘤細胞凋亡、有效抑制腫瘤細胞增殖、下調(diào)腫瘤細胞釋放相關免疫抑制因子、降低腫瘤相關基因的表達率、拮抗細胞多藥耐藥性、防止腫瘤的復發(fā)和轉移。

肝臟大約70%的血液供應來源于門靜脈，門靜脈包含了大量胃腸道的代謝物、微生物抗原和菌群代謝產(chǎn)物。菌群代謝產(chǎn)物可影響肝臟新陳代謝，參與調(diào)控肝臟氧化、細胞因子、肝內(nèi)毒素和膽汁酸的產(chǎn)生等代謝過程，肝臟細胞因子、肝內(nèi)毒素、膽汁酸又可進一步調(diào)節(jié)腸道菌群代謝。腸肝循環(huán)將腸道微生物和肝臟在生理和病理上緊密相連，腸道菌群失調(diào)會影響肝臟的生理病理[23-25]。研究發(fā)現(xiàn)[9-10]，用抗生素處理肝癌小鼠腸道菌群，可中斷腸道菌群介導的膽汁酸代謝過程，最終使NKT(natural killer T)細胞在肝臟中大量聚集，產(chǎn)生抗腫瘤作用的Th1細胞因子IFN-γ，從而抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。此外，NKT細胞可通過清除衰老和變形的肝細胞、抑制肝癌細胞生長等發(fā)揮抗肝癌免疫應答[26]，而服用益生菌、益生元、采取糞便微生物移植等干預腸道微生物的措施有改善和治療慢性肝病和肝癌的潛力[27]。三物白散之巴豆、桔梗可調(diào)節(jié)紊亂的腸道菌群，用藥后會影響肝癌小鼠腸道菌群結構和豐度，而腸道菌群變化會影響膽汁酸代謝。前期研究證實，三物白散可有效提高肝癌小鼠Th1細胞因子表達，而膽汁酸代謝、Th1細胞因子表達與FXR表達密切相關。三物白散逆轉Th1/Th2漂移發(fā)揮正向免疫應答的更深層機制是否通過調(diào)節(jié)腸道菌群，調(diào)控FXR表達，介導膽汁酸代謝，升高Th1細胞因子水平是本實驗探討的問題。

本實驗通過對肝癌小鼠模型腹水率、死亡率、腸道菌群、細胞因子(IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ)、FXR等指標的檢測，探討三物白散逆轉Th1/Th2漂移發(fā)揮正向調(diào)節(jié)肝癌免疫應答的更深層機制。與模型組比較，三物白散組和萬古霉素組回腸組織中FXR表達受抑制，Th1因子水平升高、Th2因子水平降低，腹水率和死亡率亦低于模型組，F(xiàn)XR表達和Th1表達呈負相關，Th2表達呈正相關。消膽胺組FXR表達增加，在調(diào)節(jié)細胞因子、降低死亡率和腹水率方面，效果不佳，提示三物白散可能通過抑制小鼠回腸組織中FXR的表達，進而提高Th1水平，抑制Th2表達，逆轉Th1/Th2漂移，發(fā)揮免疫正向調(diào)節(jié)作用，肝癌小鼠腹水率低，存活率高。三物白散抑制FXR表達的作用可能與其改變腸道菌群結構有關。與模型組比較，三物白散組腸道菌群豐度和多樣性改變不明顯，可能與巴豆瀉下作用加快腸道菌群代謝產(chǎn)物的排泄，減少菌群多樣性有關，但不影響其發(fā)揮肝癌正向免疫調(diào)節(jié)功能。萬古霉素組腸道菌群豐度和多樣性均有不同程度地減少，因抗生素可直接殺死腸道內(nèi)微生物。三物白散組和萬古霉素組在綱水平的梭狀芽孢桿菌綱(Clostridia)和擬桿菌綱(Bacteroide)豐度降低，消膽胺組梭狀芽孢桿菌綱和擬桿菌綱豐度增高。三物白散對腸道菌群豐度和多樣性改善不明顯，但改變了菌群結構，梭狀芽孢桿菌豐度降低。肝臟中合成初級膽汁酸，分泌到腸道后在腸道菌群作用下轉變?yōu)榇渭壞懼幔粌H調(diào)節(jié)脂質的消化吸收，還可調(diào)節(jié)FXR活性及其下游通路，某些藥物可通過調(diào)控腸道菌群影響膽汁酸組成，進而影響FXR的活性[28]。梭狀芽孢桿菌是調(diào)節(jié)膽汁酸代謝的重要菌群。研究表明，梭狀芽孢桿菌可介導7α-脫羥基反應，使初級膽汁酸轉變?yōu)榇渭壞懼幔渭壞懼峤?jīng)腸肝循環(huán)(門靜脈)入肝，在肝臟中發(fā)生一系列病理反應，最終介導肝癌的發(fā)展。給予肝癌小鼠抗生素治療后，腸道中梭狀芽孢桿菌被殺死，中斷了7α-脫羥基反應，循環(huán)入肝的膽汁酸為初級膽汁酸，最終發(fā)揮抗肝癌免疫應答[9-10]。由此推測，三物白散可調(diào)節(jié)腸道菌群的梭狀芽孢桿菌介導膽汁酸代謝，干預FXR的表達，逆轉Th1/Th2漂移，實現(xiàn)肝癌免疫應答的正向調(diào)節(jié)。為證明此推測，需進一步實驗研究初級膽汁酸、次級膽汁酸和FXR活性、表達之間的相關性。萬古霉素可直接作用于腸道殺死梭狀芽孢桿菌；消膽胺是膽汁酸贅合物，可加速腸道膽汁酸排出體外，F(xiàn)XR表達增加，但未明顯抑制Th1和促進Th2細胞因子表達，可能與消膽胺提高腸道菌群豐度和增加擬桿菌豐度有關。有研究表明，F(xiàn)XR表達有一定抑制腫瘤增長的作用，而本實驗卻呈現(xiàn)相反的結果，可能是腫瘤的發(fā)生發(fā)展及免疫應答反應不是簡單的點與點、線與線，甚至面與面的關系，常常涉及多系統(tǒng)、多臟器、多因素，F(xiàn)XR的表達和肝癌免疫應答受到多層因素影響，因而不能準確地表達其相關性。此外，三物白散降低梭狀芽孢桿菌豐度是直接作用于腸道殺死梭狀芽孢桿菌或是加速梭狀芽孢桿菌排出體外尚未明確，還有待進一步實驗驗證。