ADSC外泌體通過MT1抑制矽肺炎癥進(jìn)展的實(shí)驗(yàn)研究

趙 鋒，劉 翔，李少民，劉 倩，劉麗娟，任曉英，李建忠

矽肺是我國高發(fā)病率和高病死率的職業(yè)病之一[1]，中老年患者是最主要的發(fā)病群體[2]。染塵巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)與矽肺的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)，探索抑制矽肺染塵巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的方案及其具體機(jī)制具有重要意義。近年來，脂肪干細(xì)胞(ADSC)外泌體抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用及其機(jī)制研究已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)[3-4]。ADSC外泌體作為ADSC治療的新興工具，具有與ADSC相似的生物活性物質(zhì)[5]。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示金屬硫蛋白Ⅰ(metallothioneinⅠ,MT1)在老年供體來源ADSC外泌體中較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)外泌體中高表達(dá)。通過回顧文獻(xiàn)，證實(shí)MT1屬于金屬硫蛋白亞型，在炎癥反應(yīng)中可抑制NF-κB信號激活[6-7]，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展。本課題擬在前期工作基礎(chǔ)上，以MT1調(diào)控為切入點(diǎn)，探討老年供體來源ADSC外泌體抑制矽肺染塵巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用及其具體機(jī)制，為矽肺治療提供思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備 實(shí)驗(yàn)中的主要設(shè)備有：恒溫振蕩器（上海精密儀器公司）；臺式離心機(jī)（美國Beckman公司）；超凈工作臺（日本Ck-2公司）；流式細(xì)胞儀（美國Beckman公司）;細(xì)胞凍存盒（美國Nalgene公司）；酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）等。

純度高于99%的SiO2購買自美國Simga公司（99%顆粒直徑≤5μm）；1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；青霉素和鏈霉素來自碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒、DAPI、Cy3及FITC染料均購自碧云天生物技術(shù)有限公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及飼養(yǎng) 健康的老年SPF級C57BL/6小鼠，12～14月齡，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。研究涉及的所有動物實(shí)驗(yàn)均獲得西安交通大學(xué)動物倫理委員會的審核批準(zhǔn)。

1.3 模型制備與分組 用含10%新生小牛血清和青鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)成細(xì)胞密度1×109AM/L的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞懸液。將接種好的6孔板中分別加入一定量的粉塵溶液(SiO2粉塵懸液),用無血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)為下列濃度:0、6.25、12.5、25.0、50.0、100.0 mg/L，將其誘導(dǎo)為染塵巨噬細(xì)胞[8]。

1.4 分離和培養(yǎng)ADSC和BMSC 健康的老年C57BL/6小鼠（21～24月齡）處死后，消毒，取附睪周邊脂肪組織，用眼科剪小心剔除血管及結(jié)締組織，剪碎后加入等體積2%Ⅰ型膠原酶，37℃孵育，10 min震蕩1次。篩網(wǎng)（100目）過濾組織，1200 r/min離心5 min，含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，接種。處死健康的老年C57BL/6小鼠（21～24月齡），取雙下肢骨髓，離心后將10 ml預(yù)先冷卻的PBS重新懸浮制備細(xì)胞混勻液。2 ml 10%FBS培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后接種于小皿中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.5 建立MT1功能過表達(dá)/缺失ADSC模型 為研究MT1的功能，利用慢病毒介導(dǎo)的基因過表達(dá)/shRNA載體感染ADSC[9]，建立MT1蛋白過表達(dá)和功能缺失的ADSC，利用Western blot檢測是否構(gòu)建成功。

1.6 SiO2粉塵刺激巨噬細(xì)胞形成染塵巨噬細(xì)胞將1×106RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入SiO2懸液，配置成SiO2濃度為100μg/ml，加入到巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，將其誘導(dǎo)為染塵巨噬細(xì)胞[8]。

1.7 免疫共沉淀檢測MT1蛋白與磷酸化NIK蛋白存在相互作用 取MT1過表達(dá)/shRNA載體感染ADSC和BMSC無血清的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。提取染塵巨噬細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE上樣進(jìn)行電泳，用半干轉(zhuǎn)印儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，按1∶1000的比例稀釋IgG抗體、MT1抗體、NIK抗體，4℃過夜后加入1∶3000稀釋的二抗，室溫孵育1 h后，進(jìn)行顯色。

1.8 檢測NF-κB p52、NIK和IKKα蛋白磷酸化水平 取5×106個染塵巨噬細(xì)胞，PBS洗3次，提取細(xì)胞蛋白，調(diào)整濃度后蛋白上樣，檢測檢測磷酸化IKKα、磷酸化NF-kBp50、磷酸化NF-kBp52、磷酸化NIK、磷酸化NF-kBp65、磷酸化NF-kBp100、和RelB的蛋白表達(dá)，結(jié)果掃描并定量分析，以βactin為內(nèi)參。

1.9 ELISA檢測染塵巨噬細(xì)胞炎癥因子的分泌收集染塵巨噬細(xì)胞24h上清液，根據(jù)IL-1β、IL-6及TNF-αELISA試劑盒的要求，將捕獲抗體、檢測抗體及標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至儲存濃度。依照說明書，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，每孔加入100μl不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或者待測培養(yǎng)上清。PBS沖洗后，加入辣根過氧化物酶后孵育20 min，顯色后避光孵育20 min，使用酶標(biāo)儀在450 nm處讀數(shù)，計(jì)算出相應(yīng)細(xì)胞因子濃度。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為計(jì)量資料，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，同時間點(diǎn)多組別間的測量值比較采用單因素方差分析（AN OVA），當(dāng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用SNK法進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADSC_MT1過表達(dá)和ADSC_MT1 shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染影響外泌體中MT1蛋白表達(dá) 對ADSC_MT1過表達(dá)和ADSC_MT1 shRNA組ADSC轉(zhuǎn)染48 h后，根據(jù)倒置熒光顯微鏡下觀察，ADSC可見明顯的綠色熒光，證明慢病毒轉(zhuǎn)染成功。為了研究轉(zhuǎn)染效果，以β-actin作為內(nèi)參，通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后MT1的蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)ADSC_MT1 shRNA組的MT1蛋白表達(dá)水平較ADSC_MT1過表達(dá)組降低。見圖1。

圖1 ADSC_MT1過表達(dá)和ADSC_MT1 shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染效果

2.2 ADSC外泌體中MT1蛋白與染塵巨噬細(xì)胞中磷酸化NIK蛋白存在相互作用 將MT1與磷酸化NIK進(jìn)行免疫共沉淀，分析結(jié)果顯示MT1處有明顯的差異條帶，說明用免疫共沉淀方法證實(shí)MT1與磷酸化NIK存在相互作用。通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢SiO2組NF-kBp50和NF-kBp52的蛋白表達(dá)水平，表明ADSC_MT1過表達(dá)組的NF-kBp50和NFkBp52蛋白表達(dá)水平較SiO2組過表達(dá)組降低。見圖2。

圖2 MT1與磷酸化NIK存在相互作用

2.3 MT1抑制NF-κB p52、NIK和IKKα蛋白表達(dá)水平 ADSC過表達(dá)組較其他組更顯著抑制了NF-κB p52、NIK和IKKα磷酸化蛋白水平的表達(dá)。ADSC-shRNA組對NF-κB p52、NIK和IKKα磷酸化蛋白水平抑制最弱。見圖3。

2.4 ELISA檢測染塵巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子分泌 ELISA結(jié)果顯示MT1過表達(dá)顯著抑制了染塵巨噬細(xì)胞細(xì)IL-1β、IL-6及TNF-α分泌量。巨噬細(xì)胞經(jīng)過SiO2組激后，明顯增加了TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量。同時分別加入ADSC_MT1過表達(dá)組較ADSC-shRNA組相比，明顯降低了TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量。見圖4。

圖4 ELISA檢測IL-1β、IL-6及TNF-α分泌

3 討論

矽肺是我國最常見的一種職業(yè)病，嚴(yán)重危害患者的健康。研究已經(jīng)證實(shí)，粉塵致肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)是矽肺形成的一個重要環(huán)節(jié)[1-2]。 當(dāng)粉塵進(jìn)入機(jī)體后，肺泡巨噬細(xì)胞聚集到損傷組織周圍并激活NF-κB信號通路，該通路的激活導(dǎo)致巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞及相關(guān)因子聚集，加速肺部炎癥和纖維化反應(yīng)[3]。雖然經(jīng)過醫(yī)務(wù)工作者和研究人員的不斷努力，但臨床上尚未找到有效的矽肺治療方法。自身來源的間充質(zhì)干細(xì)胞因無倫理限制、抗炎、易于分離和培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)[4]，已成為矽肺治療的研究熱點(diǎn)。BMSC因無免疫原性和無倫理爭議等，是目前研究最多的干細(xì)胞。然而，在臨床中發(fā)現(xiàn)骨髓含量隨著衰老迅速減少。但老年患者脂肪來源豐富，可以從皮下脂肪組織中大量獲取。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)矽肺患者群體中，以中老年患者居多，因此對于大部分矽肺患者而言，ADSC較BMSC來源豐富。最新文獻(xiàn)和前期研究同樣發(fā)現(xiàn)，而且老年患者來源ADSC具有更顯著的抗凋亡能力[5,10]。

既往研究和前期結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADSC和BMSC移植可通過抗炎反應(yīng)抑制矽肺的發(fā)生、發(fā)展，對矽肺有著積極的治療作用[4,11]，而且ADSC較BMSC更顯著的降低了炎癥反應(yīng)[6-7,12-14]。外泌體是一種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)信息復(fù)合體，含有各種與來源細(xì)胞相似蛋白、RNA、micRNA及siRNA等生物活性物質(zhì)[15]，現(xiàn)廣泛用于科學(xué)研究[16]。研究證實(shí)ADSC外泌體可抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[17-18]。MT1屬于金屬硫蛋白亞型，MT1可通過抑制NF-κB信號激活[19-20]。然而，MT1抑制NF-κB信號的機(jī)制存在爭議。既往研究發(fā)現(xiàn)NIK主要通過經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路激活NF-κB[21]。

本研究為進(jìn)一步研究ADSC與BMSC外泌體中MT1對染塵巨噬細(xì)胞的作用，前期成功構(gòu)建了MTI過表達(dá)和MTI敲減的ADSC，通過Western blot證實(shí)轉(zhuǎn)染影響了ADSC外泌體中MTI蛋白表達(dá)水平（圖1）。將MT1與磷酸化NIK進(jìn)行免疫共沉淀，Western blot結(jié)果顯示MT1與NIK存在相互作用，提示ADSC外泌體中的MT1可能通過NIK發(fā)揮抗炎作用（圖2）。為進(jìn)一步明確MT1通過NIK激活NF-κB的具體機(jī)制，將添加了ADSC外泌體培養(yǎng)的染塵巨噬細(xì)胞行Western blot檢測磷酸化NF-κBp50和磷酸化NF-κBp52蛋白水平，結(jié)果顯示ADSC外泌體更顯著抑制了NF-κBp52蛋白磷酸化水平，提示ADSC外泌體中MT1可能主要通過非經(jīng)典通路發(fā)揮抗炎作用。研究證實(shí)，NF-κB誘導(dǎo)激酶(nuclear factor κB-inducing kinase,NIK)是NF-κB經(jīng)典信號通路和非經(jīng)典信號通路的共同上游激酶，對促進(jìn)NF-κB的激活至關(guān)重要，既可 以通過NIK/IKKα(inhibitor kappa B kinase-α)/IKKβ經(jīng)典通路激活NF-κB(p50/p65)，也可以通過NIK/IKKα/P100非經(jīng)典通路激活NF-κB2(p52/RelB)。本研究通過Western blot檢測添加了ADSC外泌體培養(yǎng)的染塵巨噬細(xì)胞磷酸化NIK、磷酸化IKKα和磷酸化NF-κBp52炎癥蛋白水平，結(jié)果顯示MT1過表達(dá)顯著抑制了非經(jīng)典通路中蛋白表達(dá)，表明ADSC外泌體中MT1通過NF-κB經(jīng)非經(jīng)典信號通路NIK/IKKα/P100抑制染塵巨噬細(xì)胞炎性進(jìn)展。此外，ELISA檢測結(jié)果顯示，外泌體中MT1蛋白表達(dá)越高，染塵巨噬細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6及TNF-α越低，提示ADSC外泌體中MT1抑制了染塵巨噬細(xì)胞IL-1β、IL-6及TNF-α分泌。

綜上所述，本研究提出科學(xué)假設(shè)：老年供體來源ADSC外泌體具有抑制矽肺炎癥反應(yīng)的作用，可能主要通過MT1抑制染塵巨噬細(xì)胞中非經(jīng)典通路NIK/IKKα/P100介導(dǎo)的NF-κB2(p52/RelB)激活發(fā)揮抗炎作用。