復方中草藥對羅氏沼蝦堿性磷酸酶（AKP）和血清蛋白的影響

洪迪珊，王余德

（湖南師范大學生命科學學院，省部共建淡水魚類發育生物學國家重點實驗室，長沙 410081）

羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）屬節肢動物門（Arthropod）、甲殼綱（Crustacea）、十足目（Decapoda）、長臂蝦科（Palaemonidae）、沼蝦屬（Macrobrachium），是一類大型淡水經濟蝦，原產于東南亞（主要是馬來西亞），素有淡水蝦王之稱，被引進到世界各地，成為世界養殖產量最高的三大蝦種之一［1］。羅氏沼蝦具有生長快、個體大、食性廣、生長周期短、易飼養等優點，是一種理想的養殖品種，且營養豐富（可食部分蛋白質含量為20.5%）、味道鮮美，是廣受國際水產品市場和世界蝦類養殖業者喜愛的養殖水產品。但是，隨著羅氏沼蝦的推廣逐步走向集約化養殖，人們在追求產量的同時卻降低了對其種質的要求。這一現象主要體現為育苗親本的選育不嚴格、蝦苗營養供給不足等。除此以外，在養殖過程中大量使用抗生素及化學藥物的現象時有發生，致使某些病原微生物的耐藥性增強，其抗病力強的特點已經不復存在。白濁病（whitish muscle disease）、桃拉病毒（Taura syndrome virus）和傳染性及皮下造血組織壞死病毒（infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus）對羅氏沼蝦養殖業造成了嚴重影響。加上環境污染等原因，使得水產養殖業的經濟損失巨大［2］。隨著人們生活水平的提高，國內外對水產品質量的要求逐年提高，抗生素及化學藥物將受到嚴格限制，因此，提高機體自身的免疫力是解決病害問題的關鍵，加緊關于復方中草藥對提高羅氏沼蝦免疫力的研究是有必要的。

中草藥源于天然并保持了它們的自然結構和生物活性，是動物體最易接納的純天然物質。其主要活性物質如多糖、甙類、生物堿、黃酮類等通過對動物機體免疫系統的刺激而呈現較為典型的非特異性免疫和特異性免疫作用［3］。除了含有免疫物質外，中草藥還含有一些未知的促進生長活性的因子及一定量的蛋白質、氨基酸、糖類、礦物質、維生素、脂肪等營養物質，這些成分可以增強食欲、促進機體代謝和消化酶的分泌，有利于提高營養物質的利用率，從而加速水產動物的生長發育，降低飼料系數，增強水產動物體質，進而提高機體的免疫力和抗應激能力［4］。研究表明，中草藥制劑在防病、抗病和抑菌方面有著獨特的功效［5-8］，而選擇多種具有不同藥理作用的中草藥組成復方中草藥制劑可以得到藥效互補、療效增強的效果。作為一種飼料添加劑，中草藥制劑具有增強家禽免疫力、提高家禽生產性能、防病治病等功能。其與傳統抗生素添加劑相比，有著來源廣泛、生產成本低、不易產生耐藥性和不易殘留的優勢［9］。本試驗探討了飼料中按質量比1∶1∶1∶1添加黃芪（Astragalus mongholicus）、板藍根（Isatidis radix）、杜仲（Eucommia ulmoides）、魚腥草（Cordate houttuynia）制成的復方中草藥制劑對羅氏沼蝦的生長性能和免疫活性產生的影響，為羅氏沼蝦的生態健康養殖提供保障。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的羅氏沼蝦于2018 年7 月取自長沙市大成橋鎮鵲山村羅氏沼蝦養殖場 （勝蝦場）。蝦苗個體大小均勻，活力強，腸胃飽滿。在靜止狀態下，大部分蝦苗呈伏底狀態，受到水流刺激后有頂水現象。取回后飼養于湖南生物研究所露天平臺上，試驗用水箱規格為內徑80 cm、高100 cm 的圓形黑色水箱。于每個水箱取5尾蝦稱重、測體長，求其平均值并記錄數據。養蝦用水需要事先將自來水存于干凈水箱中曝氣1～2 d，并調節自來水的軟硬度（于每桶水中加入0.4 g Na2S2O3、2.0 g葡萄糖、3.0 g NaOH），注意調節水的pH在7～8，水溫控制在20～30℃（若水溫低于16℃，羅氏沼蝦易大量死亡）。

1.2 試驗設計

試驗設置對照組C K（0%）及A（1.0%）、B（1.5%）、C（2.0%）、D（2.5%）、E（3.0%） 5個質量分數梯度，每個質量分數梯度分組中各有25 只羅氏沼蝦，分別飼喂于6 個水箱中（表1）。在基礎飼料中分別添加不同質量分數的復方中草藥制劑，采用連續投喂的方法飼喂羅氏沼蝦25 d，提取羅氏沼蝦心臟血清檢測堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、溶菌酶及蛋白含量，與對照組作對比，并得出最佳中草藥的質量分數。

1.3 復方中草藥制劑

本試驗選取黃芪、板藍根、杜仲、魚腥草4 味中草藥按質量比為1:1:1:1 配成復方中草藥制劑。將中草藥制劑粉碎后進行浸泡處理，以方便復方中草藥制劑與飼料較為準確地按照質量分數梯度混合。試驗梯度：試驗飼料中分別添加質量分數為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的復方中草藥制劑，對照組飼料中不添加。

每個質量分數梯度分組的蝦每天需喂養10 g試驗飼料（日投喂量為體重的4%～10%）。將復方中草藥制劑與飼料混勻后投喂給羅氏沼蝦，配方如表1。

表1 添加復方中草藥制劑配方表Tab. 1 Formula for compound Chinese herbal medicine unit: g

1.4 飼養管理

采用定時定量投喂的方式，并根據攝食和生長情況作相應的調整，每天在08:00、12:00、17:00、21:00 時投喂，早晚2 次的投喂量為總投喂量的60%～70%。每天早晚用溫度計測量水溫，確保在20℃以上（20～30℃），并且測量水環境的pH 值，使之維持在7～8。每天換1次水（調節過pH、軟硬度、滲透壓、曝氣2 d 的貯備水），且換水時只可放出1/3的水，否則水環境會改變（以微微發綠，有藻類及浮游生物的水質為佳）。空壓泵不間斷充氣和增氧，室外自然光照。每天進行排污，發現死蝦及時撈起，稱重并做記錄。每天觀察羅氏沼蝦攝食（羅氏沼蝦腹部腸道呈黑色，飽滿）、蛻殼及生長情況。健康的羅氏沼蝦體色透明，有活力，遇水流刺激會彈開。

1.5 采樣及生長性能指標的測定

1.5.1 體長及體重

試驗結束后，于每個質量分數梯度桶中取5 尾蝦，分別用電子天平稱其體重，用游標卡尺測體長，求其平均值、體長增長率和相對增重率，并記錄下數據。其體長增長率、相對增重率、特定生長率和餌料系數的計算公式如下：

體長增長率（%）=（試驗末體長－試驗初體長）/試驗初體長×100%；

相對增重率（%）= （試驗末體重－試驗初體重）/試驗初體重×100%；

特定生長率（%/d）=（lnWt－lnWo）/t×100%；飼料系數=攝食量/（Wt－Wo）。

Wt為試驗末蝦體均重（g）；Wo為試驗初蝦體均重（g）；t為試驗時間（d）。

1.5.2 羅氏沼蝦心臟血清的提取

每個質量分數梯度桶重復取10 尾蝦，逐尾用5 mL 注射器自羅氏沼蝦頭胸甲后插入心臟取血，合并置于Eppendor 管，于冰箱4℃中保存。以5 000 r/min 離心10 min，收集血清，-70℃下保存待測。

1.6 羅氏沼蝦血清免疫指標的測定方法

1.6.1 AKP 的活力測定

參照宋善俊等［10］的方法，使用磷酸苯二鈉比色法測定血清堿性磷酸酶，見表2。

表2 AKP活力測定操作表Tab. 2 Operating table for determination of AKP activity unit: μL

1.6.2 血清及組織勻漿中的蛋白測定

均勻切取1 塊羅氏沼蝦的腹肌組織，準確稱取其重量，按重量體積比［11］加生理鹽水制備成10%的組織勻漿，1 000～3 000 r/min 離心10 min，然后取組織勻漿上清，再用生理鹽水按1:9 稀釋成1% 的組織勻漿待測。測定管分血清組及組織勻漿組，每組6 個質量分數梯度（含對照組），并且設3 組平行試驗（表3）。蛋白含量（g/L）=［（測定管OD值-空白管OD值）/（標準管OD值-空白管OD值）］ ×標準管濃度（0.563 g/L），其中OD為光密度。

表3 血清及組織勻漿中蛋白測定Tab. 3 Determination of protein in serum and tissue homogenate unit: mL

1.6.3 數據統計方法

采用 Microsoft Excel 2010 軟件對試驗數據進行方差分析，數據用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 復方中草藥對羅氏沼蝦生長的影響

由表4 和圖1 可以看出，羅氏沼蝦的特定生長率（specific growth rate，SGR）、體長增長率（growth rate of body length，LG）、相對增重率（relative weight gain rate，WG）3 項指標隨著飼料中復方中草藥制劑質量分數的增加呈現先上升后下降的趨勢，與對照組相比，試驗組3 項指標有明顯提高。飼料系數（food coefficient，FCR）與對照組相比差異不明顯，但依然呈現先緩慢下降后上升的趨勢。當復方中草藥制劑的質量分數增加到2.5%時，3 項指標達到最高，FCR 達到最低（說明飼料轉化率提高），當質量分數增加到3.0%時，3 項指標均有所降低，FCR有所升高（說明飼料轉化率降低）。當復方中草藥制劑的質量分數分別為1.0%、1.5%、2.0% 時，各項指標差異不明顯。這表明當飼料中復方中草藥制劑的質量分數為2.5% 時，羅氏沼蝦的生長性能最好。

表4 復方中草藥制劑的質量分數對羅氏沼蝦生長的影響Tab. 4 Effects of compound Chinese herbal medicine mass fraction on growth in Macrobrachium rosenbergii

2.2 復方中草藥對羅氏沼蝦血清中免疫指標的影響

表4、5 表明，隨著復方中草藥制劑質量分數的提高，羅氏沼蝦血清中的AKP 活性（圖2）以及蛋白含量（圖3）均呈現先上升后下降的趨勢。當中草藥的質量分數達到2.5% 時，AKP 的活性達到最大值，蛋白含量達到最高。當中草藥的質量分數達到3.0% 時，羅氏沼蝦血清中的AKP 活性及蛋白含量較D 組（2.5%）明顯下降，但仍高于A 組（1.0%） 。這表明當飼料中所添加的復方中草藥制劑的質量分數為2.5% 時，羅氏沼蝦血清中的AKP 活性最高，蛋白含量最大。

表5 各復方中草藥質量分數梯度分組血清中AKP及蛋白含量Tab. 5 The AKP and protein activity of the compound Chinese herbal medicine mass fraction gradient grouping in Macrobrachium rosenbergii

2.3 復方中草藥對羅氏沼蝦肌肉中蛋白含量的影響

以中草藥質量分數梯度為橫坐標、蛋白含量為縱坐標作曲線圖，羅氏沼蝦腹肌中蛋白含量為血清中蛋白含量下方一條平滑的曲線（圖4）。由圖4可以看出，復方中草藥對羅氏沼蝦肌肉中蛋白含量的影響沒有血清中蛋白含量的明顯，但仍然呈現緩慢上升后下降的趨勢。當中草藥的質量分數達到2.5%時，羅氏沼蝦腹肌中蛋白含量達到最大值。這表明當復方中草藥制劑的質量分數為2.5% 時，羅氏沼蝦的免疫力最強，對非特異性免疫活性有明顯的促進作用，并且有助于提高羅氏沼蝦的營養價值，如表6。

表6 各復方中草藥質量分數梯度羅氏沼蝦肌肉中的蛋白含量Tab. 6 The protein concentration of the compound Chinese herbal medicine mass fraction gradient grouping in Macrobrachium rosenbergii

圖1 復方中草藥制劑的質量分數對羅氏沼蝦生長的影響Fig. 1 Effects of compound Chinese herbal medicine mass fraction on growth in Macrobrachium rosenbergii

圖2 復方中草藥制劑的質量分數對羅氏沼蝦血清中AKP的影響Fig. 2 Effects of compound Chinese herbal medicine mass fraction on the AKP in Macrobrachium rosenbergii

圖3 復方中草藥制劑的質量分數對羅氏沼蝦血清中蛋白活性的影響Fig. 3 Effects of compound Chinese herbal medicine mass fraction on the protein activity in Macrobrachium rosenbergii

圖4 復方中草藥制劑的質量分數對羅氏沼蝦肌肉和血清中蛋白含量的影響Fig. 4 Effects of compound Chinese herbal medicine mass fraction on Macrobrachium rosenbergii muscle and serum protein concentration

3 討論

中草藥添加劑取自自然界，其成分具有自然的結構狀態，保持天然性外源精華，同時具有生物活性和雙向調節等優勢，毒副作用不明顯，不污染環境，抗藥性小。黃芪、板藍根、杜仲、魚腥草4 味中草藥含有多糖、甙類、黃酮、氨基酸等多種有效成分，具有促進免疫增強和雙向免疫調節的作用［12］。本試驗證明了富含這些成分的復方中草藥添加劑可明顯提高羅氏沼蝦的免疫活性。王雷等［13］利用富含上述免疫活性成分的數種中草藥物制成的飼料對中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）進行投喂，發現中國對蝦的發病率和死亡率明顯降低，體內的抗菌、溶菌活力等免疫指標均有所提高。

羅氏沼蝦屬于無脊椎動物，且其體液不具有免疫球蛋白，其主要通過非特異免疫系統和非特異免疫因子的調節來抵抗病原體的襲擊［14］。本試驗發現，隨著飼料中復方中草藥質量分數的提高，羅氏沼蝦的血清中AKP 活性、蛋白含量呈現先上升后下降的趨勢，試驗組相較于對照組有很大提高，在各試驗組中2.5%的添加量效果最好。本試驗還發現復方中草藥添加劑可明顯促進羅氏沼蝦的生長。當中草藥制劑的質量分數達到1.0%時，LG、WG及SGR 均有明顯提高。隨著中草藥質量分數的增加，3 項指標均呈現先上升后下降的趨勢，當中草藥的質量分數達到2.5%時，各項指標均達到最大值，并在提高到3.0% 時明顯下降，但仍然高于A 組（1.0%）。FCR 與對照組相比差異不明顯（P＞0.05），但依然呈現先緩慢下降后上升的趨勢。當復方中草藥制劑的質量分數增加到2.5%時，FCR 達到最低值（說明飼料轉化率提高），當增加到3.0%時，FCR有所升高（飼料轉化率降低）。結果表明，當飼料中復方中草藥制劑的質量分數為2.5%時，羅氏沼蝦的生長性能最高。這與已有的一些研究結果一致［15-17］。由此可以推測，復方中草藥制劑對羅氏沼蝦的促生長作用可能與其提高飼料營養物質消化利用率和改善消化道內環境有關。

由試驗可知，復方中草藥制劑對羅氏沼蝦蛋白含量的影響在肌肉和血清中差異明顯。這一結果與周遵春等［18］研究結果一致，證實了復方中草藥制劑對羅氏沼蝦蛋白含量具有促進作用，可推測出現這一現象可能與復方中草藥黃芪等屬于雙向免疫調節劑（對免疫功能低下者起促進作用，而對免疫機能亢進者起抑制作用［19］）有關，具體機制尚有待進一步試驗予以證實。

綜上所述，本試驗選取黃芪、板藍根、杜仲、魚腥草4 味中草藥按質量比為1∶1∶1∶1 配成的復方中草藥制劑能夠顯著提高羅氏沼蝦的生長速度，增強AKP 活性，提高羅氏沼蝦體內的蛋白含量。進而說明復方中草藥制劑作為羅氏沼蝦飼料添加劑能夠顯著提高羅氏沼蝦的生長性能和免疫力，可有效保障羅氏沼蝦的健康和養殖經濟效益，可在羅氏沼蝦養殖生產中推廣應用。