食藥用菌茯苓對藤茶的生物轉化效應

2021-05-17 07:43:54馮彥勇陳雪梅匡鳳軍楊玉娟龍玉平

湖南農業科學 2021年2期

馮彥勇，陳雪梅，匡鳳軍，郭燾，楊玉娟，周強，湯丹，龍玉平

（1. 湖南口味王集團有限責任公司，湖南益陽 413001；2. 湖南中益食品化工檢測院，湖南益陽 413001）

藤茶系葡萄科蛇葡萄屬的一種野生藤本植物，因其性涼、味甘淡，有消暑止渴、去癖消腫、止血止痛、消炎解毒、通經絡等保健功效以及治療感冒發熱、口腔潰瘍、南喉奚徒、肝炎等藥用價值，作為藥食同源的中藥材使用已有一千多年的歷史。但關于藤茶的系統研究僅有二三十年的歷史，國內外學者對該屬的8個品種進行化學成分研究發現其主要含有黃酮、鞣質、低聚芪、蒽醌、甾體、萜類等成分，其中黃酮類成分是藤茶中最主要的活性物質，包括二氫楊梅素、楊梅素、藤茶素和藤茶苷等[1-6]。食藥用擔子菌包括野生的冬蟲夏草、蟬花等以及人工栽培的靈芝、茯苓、豬苓等。這些食藥用擔子菌的共同點就是無明顯毒副作用。近代醫學研究表明，它們不僅具有傳統的益氣、強身、祛病、通經、益壽等功能，還具有很好的藥用保健價值[7-12]。

長期以來，藤茶加工主要產品為沖泡型的藤茶。在加工過程中因工藝的不同藤茶產品質量不一，但不管使用哪種加工工藝，藤茶固有的澀味均難以去除，導致藤茶的推廣應用受到限制。

基于藤茶的活性成分以及食藥用真菌的轉化作用，采用食藥用菌茯苓對藤茶進行生物轉化，分析發酵前后藤茶主要活性物質及特征香氣成分的變化，以期為藤茶資源的開發利用開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試樣品為來鳳藤茶，市場購買；主要試驗試劑有甲醇（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）、甲酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（Sigma-Aldrich 公司）、二氯甲烷（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；主要儀器設備有LC-20A 高效液相色譜儀（日本島津公司）、7890A/5975C 氣相色譜-質譜聯用儀（美國Agilent 公司）、SHZ-D 型旋轉蒸發儀（鞏義市予華儀器有限責任公司）、FZ102 型粉碎機（北京市永光明醫療儀器廠）、FA2004 型電子分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 茯苓藤茶發酵工藝取實驗室保藏的茯苓菌種，在土豆瓊脂斜面上活化，于25℃培養7 d 后接種到土豆液體培養基，至于恒溫搖床（150 r/min，25℃）培養7 d 后得到液體菌種。分別稱取一定量的藤茶于250 mL 的三角瓶中，按1 ∶20 的固液比加入水，封口后121℃滅菌20 min，冷卻后接入茯苓液體菌種，在25℃條件下發酵，并分別在發酵0、6、9、12、15 d 取樣進行后續分析。

1.2.2 樣品中活性成分及DPPH 自由基清除能力的測定茶多酚含量依據GB/T 8313—2008 茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法測定，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[13]，根據李曉芬[14]的方法測定樣品的DPPH 自由基清除能力。

1.2.3 藤茶黃酮類物質樣品制備藤茶樣品粉碎后過80 目篩，用80%乙醇以1 ∶20 的料液比回流提取1 h，離心過濾后定容到一定的體積，用0.22 μm 微孔濾膜過濾即得。

1.2.4 高效液相色譜分析黃酮類物質條件色譜柱為Hypersil C-18 反相柱（100 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A 為甲醇、流動相B 為0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫程序：0～17 min（5%～20% B）、17～47 min（20%～40% B）、47～62 min（40%～60% B）、62～80 min（60%～80% B）、80～85 min（80%～5% B）、85～95 min（5%～5% B）；進樣量10 μL；流速1.0 mL/min；柱溫室溫；檢測波長292 nm。

1.2.5 藤茶香氣精油的制備取樣品80 g，置于5 L

圓底燒瓶中，加入1 L 蒸餾水，用40 mL 的二氯甲烷在同時蒸餾萃取（SDE）裝置中提取5 h，二氯甲烷提取液用旋轉蒸發儀濃縮至2 mL，再用無水硫酸鈉除水得到藤茶香氣精油[15]。

1.2.6 氣相色譜-質譜分析香氣精油條件 GC 條件：Agilent 7890A/5975C 氣質聯用儀，色譜柱為HP-5 毛細管柱（30 m × 250 μm × 0.25 μm），進樣口溫度為220℃，檢測器溫度為200℃，分流比為20 ∶1，檢測器為FID。程序升溫條件：初始溫度50℃，保持2 min，5℃/min 升至190℃，之后以10℃/min 升至250℃保持4 min。MS 條件：接口溫度為190℃，離子源溫度230℃，電離方式為EI，掃描范圍（m/z）為20～500 amu。檢索譜庫為NIST05。

2 結果與分析

2.1 黃酮類物質含量的變化

黃酮類物質具有抗氧化、抗腫瘤、清除自由基等功效，茶葉中的黃酮類物質對其感官品質影響顯著[16]。對來鳳藤茶主要黃酮類物質（二氫楊梅素和楊梅素）含量在食藥用菌茯苓發酵前后的變化進行了分析，結果如圖1 所示，二氫楊梅素和楊梅素的含量在生物轉化前后沒有發生明顯變化。這表明采用食藥用菌茯苓對藤茶進行生物轉化不會對藤茶的主要黃酮類活性物質造成破壞。

2.2 發酵時間對樣品中活性成分及DPPH 自由基清除能力的影響

2.2.1 茶多酚茶多酚是存在于茶葉中的一類多元酚混合物，是茶葉中主要的活性物質之一，在茶湯中呈苦澀味，其含量是衡量茶葉品質的重要指標之一[17]。如圖2 所示，在食藥用菌茯苓發酵藤茶的過程中，茶多酚含量隨著發酵時間的增加呈上升趨勢，發酵至第12 d，茶多酚含量達到最高（14.62 μg/mL），比初始含量增加了5.04%，進一步延長發酵時間，茶多酚含量呈下降趨勢，茶多酚含量在發酵第15 d 下降至14.18 μg/mL。在藤茶的整個生物轉化過程中，茶多酚含量變化幅度在5%以內，表明利用食藥用菌茯苓發酵藤茶對茶多酚含量產生的影響很小。

2.2.2 多糖多糖具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗病毒、調節細胞分裂分化、降血脂和增強免疫力等，是藤茶具有保健藥用功效的主要活性物質之一[18]。由圖3 可知，食藥用菌茯苓對藤茶進行生物轉化的整個過程中，多糖的含量一直處于不斷增加的趨勢，發酵至第15 d 時，多糖含量由初始的10.25 μg/mL 增至37.63 μg/mL，增幅達218%。由于食藥用菌茯苓亦可合成多糖，因此，初步推測生物轉化過程中多糖的大幅增加是由茯苓菌發酵引起的。

2.2.3 DPPH 自由基清除能力抗氧化作用是藤茶保健藥用功效之一。食藥用菌茯苓對藤茶進行發酵的過程中，藤茶粗提物清除DPPH 自由基的能力隨發酵時間的延長呈大幅增長趨勢（圖4），增長幅度高達246%，且與多糖含量的變化呈現出一定的相關性。這可能是因為在發酵過程中，茯苓產生了大量的抗氧化活性物質（如多糖類），使藤茶的DPPH 自由基清除能力大幅提升。

2.3 藤茶香氣成分的變化

藤茶的香氣精油經GC-MS 分析和譜庫NIST05檢索匹配，共定性27 種化合物（圖5，圖6）。如表1 所示，其中主要成分為糠醛、香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內酯、2-甲基戊酸甲酯等香氣成分及棕櫚酸、亞油酸、亞麻酸等酸類物質。藤茶在發酵過程中β-紫羅蘭酮等特征香氣成分并未消失，只是相對百分含量有所改變。藤茶經茯苓發酵產生了濃郁的水果香味，其主要成分為酯類，發酵9 d 時其相對含量達到22.74%（圖7）。隨著藤茶發酵時間的延長，酸類物質的含量大幅增加，其總含量從發酵初的12.92%上升到發酵15 d 的46.59%（圖8），這將對藤茶的口感產生一定影響。