HBV感染的動物模型研究進展

楊煒峰，苗振川，宋希軍，尹 明

北京維通達生物技術有限公司，北京 100012

HBV是一種嗜肝的DNA 病毒，會引起人類急性或慢性肝炎。慢性乙型肝炎(CHB)是導致肝纖維化、肝硬化和肝癌的重要原因[1]。

1965年，Blumberg等[2]在澳大利亞土著人檢測到HBsAg，稱為“澳大利亞抗原”。1970年，Dane等[3]通過電鏡檢測到HBV完整的病毒顆粒，稱為“丹氏顆?！?。HBV有嚴格的種屬特異性，它的自然宿主限制在人類和非人靈長類動物身上，包括黑猩猩(chimpanzees)、大猩猩(gorillas)、長臂猿(gibbons)和猩猩(orangutans)。這些非人靈長類動物的研究，受到倫理和飼養等限制，只有很少的實驗室有條件開展，并且黑猩猩在歐洲已被禁止用于實驗研究[4]。直到2012年，李文輝團隊[5]發現HBV感染肝細胞的關鍵受體，是鈉離子-?；悄懰峁厕D運蛋白(NTCP)；穩定表達人NTCP的HepG2細胞系(HepG2-NTCP，自然狀態下HepG2不能感染HBV)可以感染HBV。2016年，Lempp等[6]發現，小鼠肝細胞轉入人NTCP后可以支持HBV的進入，但不能轉錄、翻譯和形成共價閉合環狀DNA(cccDNA)。2017年，Lempp等[7]將食蟹猴、恒河猴和豬的肝細胞表達hNTCP，這些細胞變得HBV易感，效率與人肝細胞相當。以上研究表明，不同物種間的差異，如肝細胞的結構、微環境和(共)受體，或者血液中的可溶性因子，影響了HBV的易感性和感染效率。這也從側面表明，HBV侵入、修復、cccDNA形成(非必須)、轉錄、復制、組裝、釋放、慢性感染和再復發機制的復雜性，特別是還未弄清楚造成物種間差異的原因，需要進行更深入的基礎研究。

目前CHB抗病毒治療通過口服核苷(酸)類似物(NUCs)可抑制HBV復制，安全性高，但很少發生HBsAg清除及血清學轉換，停藥無期；只能在不到10%的CHB患者中實現“功能性治愈”。皮下注射聚乙二醇干擾素α(PEG-IFNα)可使10%～30%的患者清除HBeAg，并發生HBsAg血清學轉換，兼具免疫調節特性；但耐受性差，存在不良反應[8]。在研的抗HBV藥物或者療法分為兩類：(1)抑制或者沉默病毒的復制，如HBV進入抑制劑、cccDNA及其轉錄活性抑制劑、基因表達抑制劑、核衣殼組裝和pgRNA包裝抑制劑、HBsAg分泌抑制劑、RNAi和Crispr/Cas技術敲除等；(2)激活或者誘導免疫反應，如免疫調節劑、干擾素、Toll樣(病原體識別受體)受體激動劑、免疫檢查點調節劑、治療性疫苗和改造HBV特異性T淋巴細胞等[8-9]。理想的臨床前動物模型既需要模型中有較高的HBV病毒含量，也需要相應的免疫環境。遺憾的是，至今還沒有建立一個有效的模型，能夠真實地再現HBV感染的免疫和發病機制。由于鴨子、土撥鼠和樹鼩是非標準化的實驗動物[4]，而hNTCP轉基因的食蟹猴、恒河猴和豬等模型還沒有成功的報道，本文主要綜述小鼠HBV模型的最新進展(表1)，為臨床前HBV藥效實驗和HBV相關研究提供參考。

表1 HBV感染的小鼠模型特征

1 HBV轉基因小鼠模型

在HBV啟動子或者小鼠肝細胞特異啟動子(如白蛋白啟動子Alb)的控制下，將編碼HBV蛋白的基因序列通過原核注射轉入到小鼠中，獲得表達HBV蛋白的轉基因小鼠，如病毒包膜(envelope，S基因)[10-12]、核心(core，C基因)[13]、前核心(precore，preC基因)[14]和X基因[15-16]。這些模型對HBV的特性驗證提供了重要的數據支持。隨后，有兩個研究小組[17-18]用全長或者超長的HBV全基因序列制成轉基因小鼠，然而僅在少數轉基因小鼠的器官中檢測到病毒復制和蛋白表達，其血清中病毒的滴度很低。

在乙型肝炎抗病毒藥物篩選方面應用較多的轉基因小鼠模型是Guidotti等[19]研發的，其在 HBV 全長序列 5′末端重復一個C基因和X基因及其增強子，構建了1.3倍全長 HBV 基因組的轉基因小鼠。該小鼠血清中可檢測到 HBsAg、HBeAg 和 HBcAg，在小鼠體內也檢測到完整病毒顆粒的形成，且病毒顆粒具有感染性。該轉基因小鼠肝臟和腎臟中有高水平的HBV表達，外周血清中的 HBV DNA 拷貝數高達 107IU/ml，其HBV 抗原轉錄水平與CHB患者相當，已經成功用于HBV合成、轉錄，病毒組裝和成熟的病毒分泌等抑制藥物的藥效實驗[20-22]。然而，由于轉基因模型中HBV整合在小鼠基因組上，是組成型表達(在胚胎期即表達)，因而對HBV有天然的免疫耐受性，不適宜于進行免疫病理學方面的研究。另外，HBV轉基因小鼠中包含了rcDNA(relaxed circular DNA)合成、轉錄，病毒組裝及成熟的病毒分泌，但未檢測到cccDNA形成，尚不清楚不能形成cccDNA的原因[23]。

為了解決HBV抗原免疫耐受的問題，王軍等[1]綜述了不同的方案，比如用HBV轉基因小鼠與免疫缺陷小鼠(如SCID、TCRα-/-，和RAG1-/-等)雜交，構建了免疫缺陷背景的HBV轉基因小鼠。這些小鼠缺失T和B淋巴細胞，給該小鼠過繼輸入相同遺傳背景的野生型小鼠脾臟細胞(T和B淋巴細胞)，使表達HBV的小鼠肝臟細胞暴露在重建的免疫系統中，得到了類似于人類的HBV感染模型，但其操作過程比較復雜，且與人類感染HBV后引起肝臟炎癥的自然病程相比仍有較大差別，表明鼠肝臟中存在與人肝臟細胞不同的特征，如存在不易感HBV的微環境或者結構等。另一種解決HBV抗原免疫耐受問題的方法是通過基因表達調控系統，如Tet-on系統，在特定的時間及部位(肝臟)誘導HBV基因表達，但該類模型同樣存在肝炎特征與人類肝炎差別較大的問題。

2 HDI小鼠模型

利用瞬態水動力機械地(高壓)將HBV DNA擠入肝細胞，可以導致短暫的HBV復制以及蛋白質合成。2002年，Yang等[24]首次建立了HBV水動力注射小鼠模型。在小鼠尾部靜脈，通過注入大量生理鹽水，相當于小鼠體質量的8%～10%，其中含有1.3倍HBV基因組DNA的質粒，在很短的時間內(5～8 s)注射到小鼠靜脈內。但是隨著小鼠體內HBV特異性抗體和細胞毒性T淋巴細胞的出現，血液中的HBV抗原通常在第7天消失；而肝臟HBV轉錄物在轉染后第15天被清除，與抗病毒抗體和抗病毒CD8+T淋巴細胞的出現相吻合。在NOD/SCID小鼠中缺乏功能性T和B淋巴細胞、HBV基因表達和復制可以持續超過81天，表明宿主的免疫反應，特別是病毒特異性CTL反應可能在抗HBV中起重要作用。

HDI小鼠模型是一種方便、可行的方法，直接用于不同基因型、變異或突變的HBV模型構建。而且HBV基因組沒有整合到宿主基因組中，為研究HBV免疫反應和發病機制提供了可能。然而，水動力注射程序導致嚴重的肝損傷，使實驗結果的解釋復雜化，尤其是在免疫反應和發病原因方面造成混淆[25]。另外，低的轉染效率(5%～10%)和持續時間短也限制了該模型的使用[26-27]。另外，小鼠的遺傳背景、年齡、性別和免疫系統狀態等也會影響HDI小鼠模型中HBV在體內的持久性[24,28]。

3 AAV-HBV 轉染小鼠模型

2001年，Sprinzl等[29]開發了腺病毒載體攜帶1.3倍的鴨HBV基因組(Ad-DHBV)，經尾靜脈注射進入小鼠體內的方法。采用類似的方法，von Freyend等[30]將含有1.3倍HBV基因組的腺病毒載體(Ad-HBV)注射到C57BL/6小鼠體內，在小鼠肝臟中檢測到3個月以上的HBV轉錄產物。由于腺病毒載體很大，同時編碼一些非HBV病毒產物，這些產物也可能誘導免疫反應來清除HBV[31]。

肝細胞靶向AAV載體具有低免疫原性的特點，將AAV-HBV通過小鼠尾靜脈注射，成功建立了AAV-HBV小鼠模型[32-33]。這類模型可以持續產生HBV病毒顆粒和HBV抗原且1年以上無血清轉化，重現了臨床CHB患者的部分免疫學特征。因而，AAV-HBV模型也被用于評估新的基于免疫的療法和抗病毒治療[34]。目前常用的rAAV8-1.3HBV病毒載體，經尾靜脈注射到野生 C57BL/6小鼠體內，其表達水平隨重組病毒注射劑量的增加而升高，高劑量注射時可造成超過40%的肝細胞感染HBV，血清中HBV DNA可達105IU/ml。但要注意不同小鼠品系HBV感染的表型存在差別。

2017年Lucifora等[35]報道通過Southern印跡分析可檢測到AAV-HBV中存在cccDNA，然而這些cccDNA，是不是通過小鼠肝細胞中的rcDNA前體產生的仍不清楚，目前也無新的研究報道。另外在這些模型中，HBV的復制不是由cccDNA直接驅動的，而且重組AAV基因組進入體內后，一部分可以形成大的多聚體并整合到宿主基因組中，從而使得這些模型與cccDNA的相關性降低[36]。盡管如此，AAV-HBV模型仍是用于評估免疫療法和抗病毒治療的主要模型。

4 cccDNA替代小鼠模型

HBV感染的人肝臟細胞中含有3.2 kb松弛環狀rcDNA，在細胞核中，rcDNA修復為cccDNA是病毒轉錄復制的起始模板。cccDNA轉錄的病毒前基因組RNA(pregenomic RNA，pgRNA)在細胞質內包裝入核衣殼，通過反轉錄起始病毒DNA合成，成熟的病毒核衣殼顆粒再次轉運至細胞核，完成細胞內的病毒復制周期。HBV基因組高度壓縮，難以容納外源性序列[37]。已經開發了多種途徑，通過體外重組生產cccDNA(recombinant cccDNA，rcccDNA)[38]，rcccDNA與野生病毒cccDNA具有較大相似性，能夠在細胞內或體外系統大量誘導產生，是HBV研究的一類重要工具。

2014年Qi等[39]開發了一種基于HDI的重組cccDNA小鼠模型，通過Cre/loxP介導的DNA重組在體內生成cccDNA。在HBV基因組兩側引入同向LoxP位點，由重組酶Cre 引發LoxP位點之間的DNA重組和環化，生成含有單拷貝LoxP位點的rcccDNA；LoxP位點則位于一段約90 bp的外源性內含子中(HBsAg基因近5′端)，可在RNA轉錄過程中移除，實現所謂的無縫插入。然而，該模型中病毒復制水平較低，體內持續時間較短，可能是由于轉染細胞中Cre依賴性重組酶激活了免疫系統。另外兩個含DNA的細菌質粒共轉染，重組效率低，導致cccDNA轉染肝細胞非常低。傳統的含有DNA的細菌質粒，導致體內轉基因的快速轉錄沉默，即使載體DNA仍然保留在細胞中。Kay等[40]開發了一種PhiC31整合酶介導的分子內重組技術，以制備無細菌主鏈的微型環載體DNA，可在體外和體內表達高水平的轉基因?；诖竽c桿菌PhiC31重組酶誘導表達系統，建立了一種體外誘導rcccDNA attR微環產生和純化的策略，純化的rcccDNA attR微環具超螺旋結構，能夠支持功能性的HBV復制和抗原表達。由于rcccDNA編碼中包含外源內含子序列，應用引物特異性PCR方法易于與HBV DNA復制中間體及從頭合成的新生cccDNA區分。最近，在采用復制缺陷腺病毒載體將rcccDNA轉入肝臟特異的Cre小鼠中檢測到HBV的時間超過62周[41]。在小鼠肝臟中，觀察到了持續壞死性炎癥反應、纖維化和肝硬化等病理學特征，與臨床慢性肝炎相似。Yan等[42]發表的文章中，將39 bp的attR位點設計插入在HBV多聚酶基因的spacer區(PreS1起始密碼子前)，顯示并不影響病毒復制。通過免疫正常的小鼠尾靜脈HDI注射rcccDNA，可短期誘導HBV抗原血癥(平均5～7周)，與急性HBV感染相似。他們比較了C3H/HeN、FVB/N和CBA/J三種小鼠，其中C3H/HeN小鼠感染率最高，半數以上小鼠體內HBV復制持續1年以上。cccDNA替代模型可用于研究慢性病的免疫反應和發病機制，這也有助于評估cccDNA靶向抗病毒藥物策略。然而，由于這類模型仍是小鼠的肝臟細胞，不涉及HBV的入侵、擴散和再傳染的過程，仍不能替代人鼠嵌合肝臟人源化小鼠模型。

5 人鼠嵌合肝臟小鼠模型

通過小鼠的脾臟異種移植人原代肝細胞(primary human hepatocytes，PHH)，可以整合到免疫缺陷的肝損傷小鼠的肝實質中。這樣獲得的人鼠嵌合肝臟小鼠可以更好的模擬HBV自然感染和cccDNA復制過程。目前，文獻報道或商品化的主要有5種人源化肝臟小鼠模型(表2)。

表2 人鼠嵌合肝臟小鼠(人源化肝臟模型)模型

5.1 uPA-SCID小鼠 尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，uPA)在細胞外基質的降解過程中發揮重要作用。uPA系統包括uPA、uPA受體和它的2種抑制劑——纖維蛋白溶酶原激活質抑制物PAI-1和PAI-2。纖溶酶通過直接或間接激活基質金屬蛋白酶(MMP)來降解細胞外基質和層黏連蛋白、纖維連接蛋白、纖維蛋白聚糖、Ⅳ型膠原等基膜成分。uPA 參與多種生理和病理過程，在肝臟再生過程中uPA 通過激活纖溶酶清除壞死的細胞，并且能夠降解胞外基質促進肝小葉結構的重建。早在1991年Sandgren等[43]就做出了Alb-uPA轉基因小鼠，由于uPA的肝毒性，Alb-uPA小鼠在出生4天就會出現出血癥狀。2000年Weglarz等[44]作了改進，制作了MUP-uPA轉基因小鼠，使用MUP增強子/啟動子在肝細胞中特異性表達uPA，用來研究肝細胞移植。與Alb-uPA類似，由于基因丟失，uPA的表達會逐漸降低；不同的是MUP-uPA小鼠要到2～4周之后才會開始表達uPA，從而降低新生小鼠的病死率。MUP-uPA小鼠的人源化肝臟重建水平比較低。2004年，Tateno等[45]報道了uPA-SCID小鼠，可以高水平人源化重建小鼠肝臟。uPA-SCID小鼠需要在出生后2周內重建肝臟，繁殖比較困難，屬于不能調控的肝損傷模型。

5.2 FRG小鼠 2007年，Azuma等[46]報道了FRG小鼠，即將延胡索乙酰乙酸水解酶基因(fumarylacetoacetate hydrolase，Fah)敲除小鼠回交到Rag2-/-&Il2rg-/-敲除的高度免疫缺陷背景，可以實現高水平的人源化重建。小鼠Fah基因敲除后，酪氨酸在體內代謝障礙，造成延胡索乙酰乙酸(fumaryl acetoacetate，FAA)積累，從而引起肝細胞的損傷。NTBC是4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶的抑制劑，可以阻止FAA的積累，服用NTBC可以有效地改善酪氨酸血癥的癥狀。FRG小鼠繁育時喂飼低酪氨酸日糧或者飲水補充NTBC。若需要肝損傷重建時，可以逐步撤去NTBC，屬于可調控肝損傷模型。

5.3 TK-NOG小鼠 TK-NOG小鼠是另一種誘導性肝損傷模型，由白蛋白啟動子驅動單純皰疹病毒肝特異性表達病毒1型胸苷激酶(HSVtk)，然后回交到NOD/Shi scid小鼠背景[47]。因為陽性雄鼠不育，這個模型擴繁困難。

5.4 AFC8小鼠 2011年，Washburn等[48]報道了一種在Alb啟動子之后表達融合蛋白FK506結合蛋白(FKBP)和caspase8的轉基因小鼠(AFC8)，該小鼠模型受到AP20187(一種二聚體FKBP)選擇性調控，然后通過回交的方式獲得了Balb/C Rag2-/-&Il2rg-/-背景的AFC8小鼠。這個模型的人源化肝重建水平比較低(約30%)。

5.5 URG?小鼠 該模型是國內最早的人源化肝臟小鼠模型。URG小鼠由4種基因修飾動物模型交配獲得，包含2個轉基因和2個基因敲除。其核心模型源于2009年Song等[49]構建了TRE-uPA轉基因小鼠和Alb-rtTA轉基因小鼠，然后交配獲得了Alb-rtTA/TRE-uPA雙陽性小鼠；通過Dox誘導，在該小鼠中檢測到uPA表達和肝損傷。北京維通達生物技術有限公司的研發人員將Alb-rtTA/TRE-uPA雙陽性小鼠連續8代回交到NRG(NOD背景Rag2null/ Il2rgnull小鼠)背景，2012年獲得Alb-rtTA/ TRE-uPA/Rag2null/Il2rgnull小鼠。作為新一代的可調控肝損傷人源化肝臟小鼠模型，人源肝臟細胞可以實現高達95%整肝重建，滿足HBV藥物的藥效、藥代和藥動等相關實驗需要。使用該模型，也發表了一系列高水平研究論文[50-53]。

宿主免疫應答在HBV感染中起著至關重要的作用，然而上面5種人鼠嵌合肝臟小鼠，均為高度免疫缺陷背景，無法直接用于HBV特定的免疫和炎性反應研究。Washburn等[48]開發了一種人源化小鼠模型(AFC8-hu-HSC/Hep小鼠)，共移植人CD34+造血干細胞(HSC)與肝細胞祖細胞進入新生(出生后第1周內)的轉基因小鼠，同時具有人類免疫系統和人的肝細胞。但是這個模型人肝細胞重建水平低，也未檢測到抗原特異性B淋巴細胞和T淋巴細胞反應。2014年，這個小組建立了A2/NSG/Fas hu-HSC/Hep雙人源化小鼠模型(人HLA-A2轉基因的NSG小鼠)，人HLA-A2轉基因促進人MHC限制性T淋巴細胞的發育；小鼠特異性抗Fas激動劑治療抗體(JO2)支持人體免疫細胞和肝細胞的再增殖[54]。A2/NSG/Fas hu-HSC/Hep小鼠可支持持續性HBV感染(>4個月)與HBV特異性人類免疫有關的肝纖維化；而且在HBV感染的嵌合肝臟中，觀察到活化的人M2樣巨噬細胞聚集，這與HBV引起的急性和慢性感染相似。但是，該模型移植的細胞來源于流產胎兒組織，存在倫理問題的限制。2015年,Strick-Marchand等[55]報道，使用BRGS-uPA小鼠(BALB/c Rag2-/-&Il2rg-/-NOD.sirpa uPAtg/wt)實現了更高水平的雙人源化重建。在BRGS-uPA小鼠出生后(<1周齡)輻照并移植CD34+造血干細胞重建人源性免疫系統；在4～8周時移植成年人肝細胞重建肝臟。嵌合肝臟重建水平可以達到20%～50%，且在嵌合肝臟中檢測到了多種免疫細胞亞群，可以檢測到幼稚的T淋巴細胞(CD45RA+)和成熟的B淋巴細胞，以及人源的Igs抗體。盡管人類HSC和人肝細胞的HLA不匹配，但未觀察到任何移植物排斥反應。由于肝細胞移植是在HSC注射后4～8周內進行，即在成熟T淋巴細胞出現在外周器官之前，研究人員推測肝細胞產生的同種異體抗原，呈現給發育中的胸腺細胞，使其具有耐受性；另一個解釋是肝臟微環境的耐受性，肝內抗原呈遞細胞可以將免疫應答向免疫調節表型傾斜，從而保護肝細胞免受免疫攻擊。在HBV肝細胞感染期間，免疫反應在介導病毒根除或持續存在中起著重要作用。這種新型的雙人源化模型可能是研究單感染和共感染免疫反應的一個合適的平臺，可以應用于測試新的治療策略或候選疫苗。2019年Yuan等[56]使用FRGS小鼠(Fah-/-Rag2-/-IL-2R-/-SCID)移植了人類骨髓間充質干細胞(hBMSCs)，可以轉分化為雙人源化小鼠模型(hBMSC-FRGS)，但重建水平比較低。盡管肝臟和免疫雙人源化小鼠模型理論上是完美的模型，目前仍受到生產困難、高成本和一系列倫理等因素限制。

6 小結

不清楚造成HBV嚴格種屬特異性的原因，因而HBV動物模型都存在各自的優勢和不足。盡管如此，這些模型可以部分模擬HBV感染患者的特征，合理的選擇這些模型，將有助于加快藥篩進程、驗證新療法和更快解決HBV生物學發病機制等方面的問題。由于HBV發病機制的復雜性，已經有研究表明，宿主因素影響HBV的感染。如許多基因(如HLA和IL-4)的遺傳多態性會影響抗原呈遞或細胞因子的產生，從而影響抗體的產生，導致對疫苗接種的反應程度不同。NTCP的多態性可能決定HBV進入的過程。宿主因素也可能影響先天性和適應性免疫，包括巨噬細胞的激活和吞噬、APCs的抗原呈遞以及HBV特異性T淋巴細胞的啟動和功能，從而影響HBV的清除和持續性。人類相關基因的遺傳多態性可以直接或間接地決定這些免疫功能。例如，目前的人源化NTCP轉基因或者定點敲入KI模型，只能實現HDV的瞬時感染，不能實現HBV的感染。如果，通過人源化導入HBV的受體和HBV關鍵易感基因，實現小鼠肝細胞對HBV的易感性并產生cccDNA，必將促進HBV小鼠模型臨床前模型質的飛躍。相信隨著研究的進一步突破，將會有更理想的HBV臨床前模型出現，為最終治愈乙型肝炎提供幫助。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：楊煒峰、苗振川、宋希軍負責調研整理文獻，設計論文框架，起草論文，整理數據和修訂論文；尹明負責終審論文。