靶向適應性免疫治愈慢性乙型肝炎策略及進展

朱 偉，張小勇，張大千，侯金林

南方醫科大學南方醫院 感染內科肝病中心，廣州510515

HBV屬于嗜肝病毒科、是大小約為3.2 kb的雙鏈DNA包膜病毒[1]。雖然乙型肝炎預防性疫苗被廣泛應用，但全球范圍內依然約有2.5億人處于慢性HBV感染狀態，而持續的慢性HBV感染易導致肝纖維化、肝硬化甚至肝細胞癌的發生與發展，造成嚴重的全球公共衛生負擔[2]。目前治療慢性乙型肝炎(CHB)的主要藥物包括核苷(酸)類似物和IFN，由于上述藥物無法清除作為病毒RNA轉錄模板的共價閉合環狀DNA(cccDNA)而無法有效清除HBV。目前CHB治療的目標是停止抗病毒治療后，患者血清中HBsAg檢測陰性、HBV DNA檢測陰性、肝臟生化指標正常及肝組織病變改善，即CHB的功能性治愈[3]。適應性免疫應答對于控制HBV感染起到極其重要的作用，因此通過靶向適應性免疫的手段進而治愈CHB的策略備受關注。

1 適應性免疫在HBV感染中的作用

適應性免疫應答是由體液免疫和細胞免疫組成的復雜系統，在清除游離HBV、防止HBV擴散及清除HBV感染的肝細胞過程中發揮核心作用，同時也是造成肝損傷的主要原因。

1.1 T淋巴細胞 HBV特異性CD8+T淋巴細胞可通過細胞毒效應及非細胞毒效應清除HBV感染[4]。HBV的清除伴隨著強烈、多靶點CD8+T淋巴細胞免疫應答。清除CD8+T淋巴細胞導致HBV感染的慢性化。CD4+T淋巴細胞在誘導高效B淋巴細胞及CD8+T淋巴細胞免疫應答過程中必不可少，因此HBV特異性CD4+T淋巴細胞對于控制HBV感染亦至關重要。研究[5]表明，HBV特異性CD4+T淋巴細胞在HBV感染后的7～10周即可被檢測到，這與HBV特異性抗體及CD8+T淋巴細胞出現的時間一致。在急性自限性HBV感染中，外周血中輔助性T淋巴細胞(Th)1極化的CD4+T淋巴細胞可以有效控制病毒感染[6]。雖然感染HBV后，敲除CD4+T淋巴細胞不影響HBV的清除，但感染前敲除CD4+T淋巴細胞可導致HBV特異性CD8+T淋巴細胞的缺陷從而導致HBV感染慢性化[7]。此外，CD4+調節性T淋巴細胞(Treg)是一種免疫負調節細胞，在慢性HBV感染中發揮抑制T淋巴細胞活化、增殖及IFN產生的功能[8]。

1.2 B淋巴細胞 抗-HBs不僅可以預防HBV感染，還可促進HBV的清除。研究[9]表明，靶向HBsAg中和抗體不但降低HBsAg還可減少HBV的傳播及恢復HBV特異性T淋巴細胞免疫應答。擁有抗-HBs的CHB患者發生HBV再激活的風險比單純擁有抗-HBc的患者更低[10]。利妥昔單克隆抗體清除B淋巴細胞導致HBV再激活亦證明B淋巴細胞介導的體液免疫可促進HBV的清除[11]。

1.3 樹突狀細胞(DC) 作為功能最強的專職抗原遞呈細胞，DC在天然免疫及適應性免疫中均發揮極其重要的作用。DC具有廣泛的模式識別受體，其中Toll樣受體是最具特征的，并在識別病毒或病毒抗原中發揮主要作用。DC和感染HBV肝細胞的抗原遞呈功能是初次激活HBV特異性T淋巴細胞的關鍵。DC可通過內源性抗原遞呈或交差遞呈、共刺激分子及細胞因子等途徑初次激活CD4+T及CD8+T淋巴細胞。由于HBV不感染DC，所以DC只能通過交差遞呈方式遞呈HBV抗原并激活T淋巴細胞。當DC抗原遞呈或細胞因子分泌功能受損時便會抑制HBV特異性T淋巴細胞的形成進而抑制HBV特異性細胞及體液免疫。

2 抗HBV適應性免疫的紊亂

感染HBV后，90%的嬰兒及5%的成年人會發展成CHB[12]。HBV感染慢性化的原因包括宿主因素及病毒因素，靶向HBV適應性免疫系統紊亂是HBV感染慢性化主要原因。研究HBV適應性免疫應答的特點及其在HBV感染慢性化中的機制是研發HBV治愈策略的基礎之一。

2.1 T淋巴細胞 CD8+T及CD4+T淋巴細胞主要通過細胞表面的主要組織相容復合物-抗原肽復合物識別HBV感染的肝細胞。肝細胞主要組織相容復合物下調、HBV抗原突變及HBV抗原突變對蛋白酶體降解抵抗導致T淋巴細胞無法識別HBV感染的肝細胞，進而促進HBV感染慢性化[13-14]。T淋巴細胞的耗竭也是CHB的特征之一，由于長期暴露于HBV抗原，HBV特異性T淋巴細胞逐漸失去正常的細胞因子分泌及細胞毒功能并表達多種抑制性受體，包括程序性死亡受體(programmed death-1，PD-1)、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein-4，CTLA-4)、T淋巴細胞免疫球蛋白黏液素(T cell immunoglobulin mucin-3，Tim-3)、淋巴細胞活化基因3(lymphocyte-activation gene-3，Lag-3)、含Ig及ITIM結構域的T淋巴細胞免疫受體(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains，TIGIT)及Bcl-2相互作用細胞死亡介導因子(bcl-2 interacting mediator cell death，BIM)等，通常抑制性受體在維持自身免疫耐受機制中起到核心作用。抗原刺激的水平和持續時間與慢性感染期間功能障礙的嚴重程度相關，耗竭的T淋巴細胞共表達的抑制性受體數量越高，T淋巴細胞耗竭的水平就越嚴重[15]。濾泡狀輔助CD4+T淋巴細胞(follicular helper CD4+T cells，Tfh)在維持生發中心的成熟及B淋巴細胞分化為漿細胞的過程中及其重要[16]。Tfh減少以及功能紊亂影響HBV特異性B淋巴細胞的分化及抗體生成，造成了HBV持續感染[17]。Treg主要作用是維持免疫耐受，可抑制T淋巴細胞的活化增殖及DC的成熟。CHB患者中Treg顯著增多，并且Treg的含量與血清HBV病毒載量正相關[18]。Treg/Th17的失衡是HBV相關肝硬化進展的指標及肝細胞癌發生的風險因素[19]。此外，Treg也在HBV相關肝細胞癌中顯著富集[20]。

2.2 B淋巴細胞 HBV感染同樣損傷B淋巴細胞功能。CHB患者外周血B淋巴細胞顯示更高的激活表型以及增殖缺陷[21]、抗體分泌功能減弱、分泌IL-10的不成熟調節性B淋巴細胞比例增加[22]。調節性B淋巴細胞不僅抑制細胞毒性T淋巴細胞的功能還促進CD4+T淋巴細胞向Treg細胞分化發揮細胞免疫抑制作用[23]。

2.3 樹突狀細胞(DC) 雖然HBV不感染DC，但CHB患者的DC數量及功能依然存在異常。研究[24]表明，CHB患者外周血來源的表達CD80、CD86的成熟髓樣DC細胞比例顯著降低。此外HBsAg和HBeAg均可抑制DC體外的功能[25]。抗病毒治療可抑制髓樣DC PD-L1的表達，恢復T淋巴細胞功能[26]。值得注意的是，雖然沒有直接證據證明CHB患者DC的非靶向HBV的細胞體液免疫受損，但與高病毒載量CHB患者相比，低病毒載量CHB患者擁有更高質量的DC[27]。

3 靶向適應性免疫系統治愈CHB策略

由于適應性免疫系統在HBV慢性感染中處于紊亂狀態，因此通過重建或逆轉HBV特異性的免疫策略是治愈乙型肝炎的突破點之一。目前靶向適應性免疫系統治愈乙型肝炎策略主要包括治療性疫苗、細胞免疫治療、免疫檢查點阻滯、T淋巴細胞代謝重編程及中和抗體療法(圖1)。近期開展的相關臨床試驗見表1。

圖1 靶向適應性免疫系統治愈CHB策略

表1 靶向適應性免疫系統治療CHB的臨床試驗

3.1 治療性疫苗

理想的HBV治療性疫苗需要誘導強大的HBV特異性T、B淋巴細胞免疫應答并恢復耗竭HBV特異性T、B淋巴細胞的功能。雖然目前尚未有HBV治療性疫苗上市，但多項HBV治療性疫苗臨床試驗已顯示出一定的治療效果。為進一步提高HBV治療性疫苗的療效并成功應用于臨床，HBV治療性疫苗亦需要在疫苗構型、遞送系統及抗原選擇上進一步優化。

3.1.1 GS-4774 GS-4774是基于重組、熱滅活酵母疫苗，表達HBsAg、HBcAg及X抗原。GS-4774疫苗聯合直接抗病毒藥的臨床試驗結果顯示，接種疫苗組中，約11%(5/44)的患者HBeAg消失，約9%(4/44)患者抗-HBe轉陽，HBV特異性T淋巴細胞免疫應答增強，而對照組無HBeAg消失或抗-HBe轉陽患者[28]。GS-4774疫苗聯合替諾福韋的臨床試驗結果提示，與替諾福韋單藥治療組相比，聯合治療組患者HBV特異性CD8+T淋巴細胞分泌更多TNF、IFNγ、IL-2細胞因子，其增強的T淋巴細胞功能與Treg數量呈反比[29]。

3.1.2 HB-110 HB-110是DNA疫苗，表達HBsAg、HBcAg、pre-S1、pre-S2、Pol及IL-12。該疫苗誘導靶向HBsAg、HBcAg、Pol的特異性免疫應答。約19%(5/27)的患者體內可檢測到分泌TNF、IFNγ、CD107的多功能特異性CD8+T淋巴細胞。促進并維持部分患者HBeAg的血清學轉換[30]。

3.1.3 TG1050 TG1050是腺病毒(Ad5)疫苗，表達HBcAg、Pol及部分HBsAg。在小鼠實驗中發現，單次給藥后，TG1050誘導了健壯的、多特異性的、多功能及持久的HBV特異性T淋巴細胞，這些特異性的T淋巴細胞在TG1050注射1年后仍可檢測到[31]。臨床試驗結果表明中高劑量組中，80%的患者產生靶向至少一種HBV抗原的特異性免疫應答并導致輕微的HBsAg下降(0.4 log)[32]。

3.1.4 NASVAC NASVAC是蛋白疫苗，含有HBsAg、HBcAg。Ⅰ期臨床試驗結果表明NASVAC疫苗可在所有患者中誘導抗-HBc，75%患者體內檢測到抗-HBs。Ⅲ期臨床試驗結果顯示，與PEG-IFN治療組相比，NASVAC疫苗顯著降低了血清HBV病毒載量并誘導更高的HBeAg血清轉換率[33]。

3.2 細胞免疫治療

細胞免疫療法已在血液瘤治療中取得了重大突破，目前FDA已批準5款靶向CD19的嵌合抗原受體T淋巴細胞(chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T)治療產品。細胞免疫療法也被用于探索HIV、HBV等病毒感染性疾病的治療。將擁有HBV免疫能力患者的骨髓移植給患有CHB的白血病患者可清除CHB患者體內HBV[34]。因此輸注HBV特異性細胞可成功清除HBV，甚至可以治愈乙型肝炎。

3.2.1 工程T淋巴細胞 90%成人急性HBV感染出現自發性HBsAg清除，同時伴有強烈的T淋巴細胞免疫應答。而慢性乙型肝炎患者由于多種耐受機制導致缺乏足夠HBV特異性T淋巴細胞進而無法清除病毒，因此過繼輸注HBV特異性的工程T淋巴細胞是一種可行的乙型肝炎治療策略。目前工程T淋巴細胞主要包括T淋巴細胞受體T淋巴細胞(T cell receptor T-cell，TCR-T)和CAR-T。用于治療HBV感染的主要靶點為HBsAg和HBcAg。靶向HBsAg的CAR-T淋巴細胞特異性識別并殺傷HBsAg陽性的HepG2.2.15細胞[35]，在人源化HBV小鼠模型體內擴增及顯著抑制HBV復制，同時誘導短暫的肝損傷[36]。在人肝嵌合小鼠模型中顯著降低血清HBsAg、病毒載量及HBV感染肝細胞的比例[37]。HBsAg特異性TCR-T可以識別HBV感染的肝細胞并顯著降低人源化HBV小鼠模型中HBV DNA[38]。親和力增強的TCR-T即保留了HBV抗原特異性，還可識別廣泛的HBV基因型變異，具有更好的抗原識別敏感性和細胞毒性，該TCR-T在小鼠模型中可以完全消除HBV相關肝癌并抑制其復發[39]。臨床試驗提示靶向HBsAg的TCR-T識別HBV相關肝癌細胞，在患者體內存活并增殖，同時降低HBsAg并且顯示良好安全性[40]。過繼性T淋巴細胞療法的局限是成本高、治療時間長。新型可溶TCR策略無需在體外處理T淋巴細胞，已被成功用于治療HIV感染。這種可溶性TCR策略被稱為抗病毒免疫激動單克隆T淋巴細胞受體(immune mobilising monoclonal TCRs against virus，ImmTAV)，它本質上屬于一類新型的雙特異性生物大分子，是由工程化改造的TCR以及抗-CD3的單鏈抗體組成。一款叫做IMV-I109V的ImmTAV可以有效激活T淋巴細胞并特異性清除整合了HBV DNA及HBV感染的肝細胞[41-42]。CHB的T淋巴細胞免疫療法有待進一步在臨床試驗中研究。

3.2.2 DC細胞 髓系來源的DC調控HBV特異性T淋巴細胞的功能性分化，通過活化CD40信號通路恢復耗竭的HBV特異性T淋巴細胞的功能。HBsAg/HBcAg負載DC策略在小鼠模型中成功誘導HBV特異性T淋巴細胞免疫應答[43]。自體回輸負載HBV抗原的DC可以有效抑制HBV復制，降低病毒載量，清除HBeAg并誘導HBeAg血清學轉化，甚至導致HBsAg清除[44]。另一種基于DC的細胞療法是樹突狀細胞-細胞因子誘導的殺傷細胞(dendritic cells-cytokine induced killer，DC-CIK)。DC-CIK療法是將DC與CIK共培養同時負載抗原肽，誘導特異性的T、B淋巴細胞擴增并激活自然殺傷細胞，最終將DC和CIK自體細胞回輸至患者體內。臨床試驗結果表明63.6% (21/33)的CHB患者在回輸HBsAg激活的DC-CIK后病毒載量下降2 log[45]，有部分患者甚至出現HBsAg血清學轉換[46]。由于DC免疫療法用于CHB治療的研究數量有限，因此該療法有待進一步研究。

3.3 免疫檢查點阻滯 耗竭T淋巴細胞表達特定的抑制性受體，利用抑制性受體抗體可部分恢復耗竭T淋巴細胞的功能。免疫檢查點阻滯已應用于多種腫瘤治療，在部分患者中顯示出良好的療效。CHB患者體內的HBV特異性T淋巴細胞同樣存在功能缺陷并高表達PD-1、CTLA-4等抑制性受體。HBV感染導致肝細胞PD-L1表達升高更加重了HBV特異性T淋巴細胞的耗竭。多項研究顯示利用PD-1阻滯至少可以在一定程度上恢復耗竭的HBV特異性T淋巴細胞。土撥鼠肝炎模型中，使用PD-L1抗體聯合恩替卡韋和DNA疫苗成功增強HBV特異性T淋巴細胞功能，導致病毒的持續控制以及抗-土撥鼠肝炎表面抗原的產生，甚至清除部分土撥鼠肝炎病毒感染[47]。PD-L1增強來源于HBeAg陰性患者的OX40活化的HBV特異性CD4+T淋巴細胞功能，分泌更多的IFNγ和IL-21，因此PD-1免疫檢查點阻滯聯合OX40激動劑可能更有利于乙型肝炎治愈[48]。不同的T淋巴細胞亞群、CD28共刺激分子及抑制性受體表達水平均會影響免疫檢查點阻滯的敏感性，并可作為預測療效的指標[49-51]。與外周血淋巴細胞相比，肝內淋巴細胞甚至展示出更佳的PD-L1阻滯治療的敏感性[26]。PD-1免疫檢查點抑制劑納武利尤單抗治療病毒抑制狀態的HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者的臨床試驗結果顯示，大多數納武利尤單抗治療患者的HBsAg水平下降，其中1例患者在治療后發生HBsAg血清學轉換及HBsAg特異性T淋巴細胞顯著增加[52]。除了PD-1/PD-L1分子，阻滯其他免疫檢查點如Tim-3、CTLA-4亦有望恢復HBV特異性T淋巴細胞的功能。

3.4 T淋巴細胞代謝重編程 T淋巴細胞的分化、激活以及記憶性表型的產生均需要代謝過程參與。越來越多的研究表明T淋巴細胞耗竭與代謝紊亂有關，T淋巴細胞早期代謝的改變甚至發生在病毒特異性T淋巴細胞嚴重耗竭之前[53]，靶向特定代謝通路可恢復T淋巴細胞功能[54]。慢性HBV感染過程中，HBV特異性T淋巴細胞的線粒體功能紊亂并且產生過量活性氧，導致T淋巴細胞生物合成及能量代謝障礙；利用靶向線粒體抗氧化劑可明顯恢復患者外周血或肝內HBV特異性T淋巴細胞的功能[55-56]。目前尚未有靶向線粒體方法治療CHB臨床試驗的報道。

3.5 HBV中和抗體 HBV通過肝細胞表面的受體感染肝細胞，因此利用抗體封閉HBV感染肝細胞的受體可以用來治療HBV感染。抗-HBs的單克隆抗體E6F6在多種HBV小鼠模型中具有顯著的抗病毒作用，單次治療即可顯著降低HBsAg和3log以上的HBV DNA；E6F6抗體在人肝嵌合小鼠模型中不僅可以預防HBV感染還可減少HBV的二次傳播，在高壓注射HBV模型中恢復HBV特異性T淋巴細胞應答；Fcγ受體依賴的吞噬作用在E6F6介導的HBV抑制中起主導作用；此外抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用及補體依賴的細胞毒性作用可能也參與了E6F6抗體的抗HBV作用[9,57]。HBV中和抗體VIR-3434的Ⅰ期臨床試驗結果顯示，6例患者接受了單劑量 6 mg VIR-3434 的用藥8 d后，血清HBsAg水平平均降低了1.3 log[58]。

4 結論及展望

HBV適應性免疫應答紊亂造成HBV的持續感染，重建HBV適應性免疫應答是治愈乙型肝炎的重要思路。雖然利用治療性疫苗、細胞免疫治療、免疫檢查點阻滯、T淋巴細胞代謝重編程、HBV中和抗體等療法可部分恢復HBV特異性免疫并在不同程度抑制HBV復制及降低血清HBsAg，甚至使部分患者達到功能性治愈，但無法在多數患者中有效清除HBV。目前尚需進一步研究CHB過程中HBV免疫病理機制，以改進優化上述療法。靶向適應性免疫療法聯合靶向天然免疫系統及直接抗病毒藥物的個體化療法可能更易實現清除HBV以及HBsAg血清學轉換，最終實現CHB功能性治愈的目標。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：朱偉、張小勇、張大千、侯金林負責提出研究選題，撰寫論文和修訂論文。