恩替卡韋對rtA181V/T突變的慢性乙型肝炎患者的抗病毒效果觀察

李淑芹，周 靜，高 遠，馬曉燕，汪莉萍

徐州醫科大學附屬醫院 感染性疾病科，江蘇 徐州 221002

慢性乙型肝炎(CHB)是全球性的公共健康問題，可引起嚴重的肝臟疾病，包括肝衰竭、肝硬化及原發性肝癌。據世界衛生組織估計，全球約有2.5億人感染HBV[1]。在CHB患者中，高水平的HBV DNA復制增加肝硬化及肝癌的發生風險。因此，通過抗病毒治療將HBV DNA載量降至非常低或無法檢測的水平，可以延緩和減少疾病進展以及降低死亡率[2-4]。目前，包括拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)、阿德福韋酯(ADV)、恩替卡韋(ETV)、替諾福韋(TDF)、丙酚替諾福韋(TAF)在內的核苷(酸)類似物(NAs)被批準用于抗HBV來預防肝臟疾病的進展。但由于cccDNA的半衰期較長，CHB患者需長期口服NAs來抑制病毒的復制，而長時間NAs治療會導致HBV逆轉錄酶(reverse transcription，RT)區發生耐藥突變的風險增加，最終影響抗病毒治療效果。

目前主要的耐藥模式(通路)有L型核苷耐藥模式(LAM、LdT)、無環磷酸鹽耐藥模式(ADV、TDF)、共享耐藥模式(ETV)、雙重耐藥模式及ETV初治耐藥模式5種[5-6]。而HBV RT181位點發生的氨基酸改變屬于多藥耐藥，會同時影響L型核苷耐藥模式和無環磷酸鹽耐藥模式，從而對LAM、ADV、LdT、TDF的藥物敏感性呈不同程度的下降[6]。此外，體外研究[7]顯示，rtA181V/T變異會影響病毒的復制，使HBsAg的分泌減少，具有潛在的致癌性[8]。研究[9]還發現181位點變異聯合其他變異后的耐藥性較其單獨變異的耐藥性增加。歐洲肝病學會指南[10]指出，ETV可作為rtA181V/T的挽救治療。對此，本研究通過回顧性分析研究ETV對rtA181V/T突變的CHB患者的抗病毒治療效果。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2012年1月—2017年1月就診于本院門診及住院部，進行HBV基因耐藥變異檢測，并排除存在對ETV耐藥變異的CHB患者(rtTl84A/G/I/S、rtS202G/I、rtM2041/V/S、rtM250V/L、rtL180M、rtM250V/L、rtV173L)。納入標準：(1)年齡18歲以上，HBsAg持續陽性≥6個月；(2)所有病例診斷均參照《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[11]。排除標準：(1)其他嗜肝病毒感染、自身免疫性肝病、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、藥物性肝損傷及遺傳代謝性肝病等；(2)既往使用PEG-IFN治療的患者；(3)不符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[11]及資料不全的患者。

1.2 治療方法 所有患者均予以ETV(正大天晴藥業集團股份有限公司，國藥準字H20100019)口服，0.5 mg，1次/d。

1.3 觀察指標及判定標準

1.3.1 檢測儀器與設備 (1)血清HBV DNA檢測：采用美國ABI公司生產的 ABI7500實時熒光定量PCR儀檢測，檢測下限為500 IU/ml。(2)血清HBeAg及HBsAg檢測：采用美國Abbott I2000全自動微粒子化學發光免疫分析儀定量檢測。HBsAg檢測范圍為0.05～250 IU/ml，>250 IU/ml時采用1∶500自動稀釋檢測，HBeAg檢測下限為0.50 PEIU/ml，<0.50 PEIU/ml定義為 HBeAg陰性。(3)采用Beckman Coulter AU5800全自動生化分析儀檢測ALT、AST、TBil。(4)HBV基因耐藥檢測：采用ABI基因測序儀3130對HBV DNA>1.0×103拷貝/ml的標本進行檢測，定量檢測HBV的P基因區有關于LAM、LdT、ADV、ETV、TDF的耐藥位點。上述所有指標均在本院感染科實驗室完成。

1.3.2 療效評估指標 依據《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[12]，病毒學應答是指治療過程中血清HBV DNA低于檢測下限。應答不佳或部分病毒學應答是指NAs抗病毒治療中依從性良好的患者，治療24周時HBV DNA較基線下降幅度<2 log10IU/ml，但仍然可以被檢測到。病毒學突破是指NAs抗病毒治療中依從性良好的患者，在未更改治療的情況下，HBV DNA水平比治療中最低點上升1個log值或一度陰轉后又轉為陽性，并在1個月后以相同試劑重復檢測加以確定，可有或無ALT升高。病毒學無應答是指NAs治療依從性良好的患者，治療12周時HBV DNA較基線下降幅度<1 log10IU/ml或治療24周時HBV DNA較基線下降幅度<2 log10IU/ml。

1.4 倫理學審查 本研究已通過徐州醫科大學附屬醫院倫理委員會批準，批號：XYFY2020-KL214-01。

2 結果

2.1 一般資料 共納入符合入組條件的CHB患者155例，按照耐藥變異類型將患者分為3組，A組：無耐藥變異72例(均為初治的CHB患者)；B組：rtA181V/T變異45例；C組：rtA181V/T+rtN236T變異38例。其中，A組男47例，女25例；年齡30～66歲，平均(47.53±9.80)歲。B組男28例，女17例；年齡32～63歲，平均(46.27±9.57)歲。C組男20例，女18例；年齡30～64歲，平均(47.42±9.54)歲。3組比較，年齡、性別以及ALT、AST、TBil水平差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表1)。

2.2 患者既往用藥情況及耐藥變異模式 本研究共隨訪了102例發生包含rtA181V/T單一或多位點突變的經治CHB患者，其中發生rtA181V/T突變者45例，包含rtA181V/T在內的多位點突變者57例。同時對于已納入的多耐藥位點患者，需排除已出現ETV耐藥位點的病例(表2)，最后符合條件的共38例，均為rtA181V/T+rtN236T變異。根據患者既往臨床NAs用藥史可知，有76例曾服用兩種及以上NAs抗病毒治療，其中47例出現多位點耐藥(61.84%)，既往單藥NAs抗病毒治療的26例患者中，10例出現多位點耐藥(38.5%)，2組患者多位點耐藥人數經χ2檢驗結果顯示，差異有統計學意義(χ2=4.295，P=0.038),表明用藥模式影響耐藥位點的發生，既往服用多種NAs的患者，更容易出現多位點突變和多重耐藥的可能。

表2 102例慢性HBV感染者既往用藥情況及耐藥變異模式

2.3 基線特征 對于B、C 2組患者來說，其初始服用NAs治療時基線HBV DNA水平[(7.08±1.59)、(6.94±1.61)log10IU/ml]比發生181位點突變時的HBV DNA基線水平[(6.22±1.48)、(5.94±1.45)log10IU/ml]較高(t=3.098，P=0.002；t=2.850，P=0.004)。當經治CHB患者出現rtA181V/T相關耐藥時，平均HBV DNA水平超過4 log10IU/ml。3組患者HBV DNA、HBsAg、HBeAg比較差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表1)。

表1 ETV挽救治療時3組患者相關基線特征

2.4 3組病毒學應答、生化學反應的比較 隨訪至48周，ETV挽救治療無1例患者出現病毒學無應答的情況，提示ETV對于發生rtA181位點耐藥變異挽救治療具有良好的效果。在ETV挽救治療24周時，A、B、C 3組分別有50、31和28例達到病毒學完全應答水平，但HBV DNA陰轉率差異無統計學意義(P>0.05)。24周時3組HBeAg陰轉情況分別為3例(4.2%)、1例(2.2%)、2例(5.3%)，差異無統計學意義(P>0.05)。治療48周3組HBV DNA陰轉率、HBeAg陰轉率比較，差異均無統計學意義(P值均>0.05)。ETV挽救治療24周及48周后3組患者的ALT、AST及TBil均下降，但3組相比差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表3)。

2.5 影響ETV挽救治療效果的單因素及多因素分析 根據是否出現HBV DNA低于檢測下限為準，將治療48周后的患者分為有效和無效組進行logistic回歸分析。單因素分析顯示，HBV DNA水平和HBeAg滴度對治療后病毒學應答有影響(P值均<0.05)(表4)。多因素分析則提示HBV DNA水平是影響治療效果的危險因素(OR=1.655，95%CI：1.128～2.428，P=0.01)。

表4 ETV挽救治療期間病毒學反應預測的單因素分析

3 討論

由于初期我國經濟條件不足，低效、高耐藥的NAs如LAM、ADV等被廣泛用于臨床中，加之醫務人員對耐藥問題認識不足，導致耐藥現已成為NAs抗病毒治療中越來越嚴峻的問題。HBV對NAs的耐藥變異往往發生在HBV RT區，而不同位點突變的情況則是由所服用的NAs所決定、所誘導。181位點變異最早是Yeh等[13]在研究LAM耐藥中發現的，而根據HBV耐藥模式通路[6]可知，181位點變異是交叉核苷和核苷酸兩大類抗病毒藥物的共同耐藥位點，會影響大部分的NAs抗病毒治療效果，包括LAM、ADV、LdT、TDF。Villet等[14]的體外研究結果顯示，rtA181V/T突變降低了對LAM(10倍)、ADV(2～8倍)和TDF(2～3倍)的敏感性。本研究共納入102例發生rtA181位點突變的經治CHB患者，結果顯示既往曾服用多種NAs抗病毒治療的患者更容易出現多位點耐藥變異。據報道[15]在歐美韓日等發達地區，有80%～90%的初治CHB患者選用高效、低耐藥的NAs治療，而我國高達81%的初治CHB患者因經濟等原因而選用了低效、高耐藥的NAs。并且隨著人們對耐藥的認識，發現了部分患者即使未使用任何NAs抗病毒治療，也會出現相關耐藥位點的預存耐藥現象[16]。因此對于CHB患者而言，初始抗病毒治療宜選用高耐藥基因屏障的一線藥物，如ETV、TDF或者TAF。對于已經選用二線抗病毒藥物的患者，在沒有發生耐藥變異前建議盡早換用一線抗病毒藥物；已經發生病毒學突破或應答不佳的情況，建議予以基因耐藥檢測，根據檢測結果選擇敏感的一線藥物，或者聯合用藥，以減少耐藥變異的發生。

rtA181位點突變是近年來耐藥變異研究的重點。該位點突變主要與LAM、ADV有關，但在目前幾乎所有的NAs治療中都可以檢測到rtA181V/T突變位點，包括具有高耐藥屏障的TDF，甚至部分發生預存耐藥的患者也能檢測出rtA181V/T突變。另外由于HBV基因組中S區完全重疊于RT區，當RT區某些堿基發生突變時，S區的改變也就相應而生。其中發生rtA181T突變，會引起S區第172位氨基酸突變成終止密碼子，從而生成了截斷的S蛋白，記作rtA181T/sW172*，而研究[13,17]表明，該截斷蛋白會影響病毒的復制、HBsAg的分泌及具有潛在的致癌性。因此，本回顧性研究追蹤了發生耐藥變異的患者初始服用NAs治療的基線水平，結果與姬粉芝等[18]的論文結果一致：發生rtA181V/T突變位點的患者其HBV DNA基線水平較服用NAs治療基線時HBV DNA基線水平有所下降。

ETV屬于一線抗HBV藥物，能快速抑制病毒復制、改善肝纖維化，并且具有很低的耐藥率[19]。歐洲肝病學會指南[10]建議ETV可作為發生rtA181V/T變異的CHB患者的挽救治療。中國學者姬粉芝等[18]在一項回顧性研究中發現對于發生rtA181位點變異的經治CHB患者，ETV單藥的效果要明顯優于LdT。韓登高等[20]研究顯示，ETV單用與聯合ADV治療rtA181V/T突變的患者在病毒學及生化學指標上均無顯著差異，而本研究選用ETV挽救治療后，3組患者治療后的HBV DNA水平明顯下降，截止至隨訪結束，大部分患者都達到了病毒學完全應答，且3組之間HBV DNA陰轉率、HBeAg陰轉率比較無顯著統計學差異，ALT、AST、TBil復常率之間也無統計學差異，且未出現病毒學突破或病毒無應答現象，說明ETV對rtA181位點突變有很好的挽救治療效果。但是作者觀察到無耐藥變異組24、48周HBV DNA陰轉率與Luo等[21]研究結果(69.4% vs 85.0%、83.3% vs 89.4%)存在差異。考慮到以下方面的原因：第一，多項研究結果表明HBV DNA高載量、HBeAg陽性、ALT低水平等影響ETV治療初治CHB患者的病毒學應答[21-22]，本文中無耐藥變異組所納入的CHB患者HBeAg均為陽性，相較于Luo等研究中的HBeAg陽性率(113/230)較高。其次，盡管在ETV治療之前已對無耐藥變異組進行基因耐藥變異檢測，但由于檢測技術有限而有可能出現漏檢情況。因此，對于初治CHB患者，服用ETV治療1年后仍有持續低病毒血癥，臨床上要如何處理？Luo等[21]的研究中對于這類患者繼續給予ETV單藥治療，結果顯示在144、192周HBV DNA陰轉率均為100%。因此，在臨床中對于治療1年仍表現持續低病毒血癥的初治CHB患者可以暫時不予以調整抗病毒藥物，但需要動態觀察HBV DNA水平，如果有持續下降之勢，則可以繼續應用;如果HBV DNA在繼續ETV抗病毒治療過程中處于平臺期，則需及時調整抗病毒方案，可以換用TDF或TAF，也可以選擇聯合用藥。

若患者服用ETV后再次出現應答不佳或耐藥，該如何治療？Lim等[23]經過96周的隨訪觀察發現TDF單藥組與ETV聯合TDF組在病毒學、生化學及血清學應答上無顯著差異。其他的研究[22,24]也表明TDF單藥治療對LAM、ADV及ETV耐藥的患者是有效的。但國外的一項隊列研究[25]顯示，與初治的CHB患者相比，TDF單藥治療對ADV耐藥患者的療效較低，尤其是對LAM、ADV均耐藥的患者。且2019年版更新的《慢性乙型肝炎防治指南》[11]也建議：對于出現LAM、ADV及ETV的多重耐藥，建議ETV聯合TDF/TAF治療。因此，對于多重耐藥CHB患者，建議選擇聯合抗病毒治療。

Li等[26]研究報道，HBV DNA水平可以預測ETV挽救治療的治療效果。本研究單因素分析發現HBV DNA水平及HBeAg滴度影響ETV抗病毒療效，但多因素分析提示初始治療時HBV DNA水平是ETV抗病毒治療48周效果的獨立預測因子。

綜上，本研究探討ETV挽救治療rtA181V/T變異及rtA181V/T+rtN236T變異患者的療效，結果表明ETV挽救治療效果較好，而基線HBV DNA水平是治療48周時抗病毒效果的唯一預測因子。但本研究仍存在一定的局限性。首先，該設計是回顧性的，為了克服由此產生的選擇偏差，本研究采用嚴格的納入和排除標準，并試圖延長觀察期。其次，1年的調查可能不足以觀察抗病毒藥物的長期療效。第三，納入患者數量相對不足(n=155)，隨訪時間較短，因此需要更長時間的隨訪來評估ETV挽救治療rtA181V/T突變患者的長期療效，以及觀察該位點耐藥變異后疾病進展情況和腫瘤發生情況等。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：李淑芹負責課題設計，資料分析，撰寫論文；周靜、高遠、馬曉燕參與收集數據，修改論文；汪莉萍負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。