癌旁組織二酯酰甘油激酶γ表達水平對肝癌患者術后生存的影響

錢相君，郭正陽，王 莉，聶涵笑，賀 濤，王效謙，萬百順，姚明解，張 玲

1 鄭州大學附屬腫瘤醫院 肝膽胰外科，鄭州 450008； 2 北京大學醫學部基礎醫學院 a.病原生物學系暨感染病中心，b.人體解剖學與組織胚胎學系，北京 100191；3 北京大學第三醫院 基礎醫學研究中心，北京 100191

肝細胞癌(HCC，簡稱肝癌)居我國最常見惡性腫瘤的第四位及腫瘤致死病因的第二位，嚴重威脅著人民的生命健康[1-3]，肝切除術是肝癌的主要治療方式之一[4]，雖然近年來肝癌的外科治療技術不斷發展，但患者的長期預后并不十分理想[5-7]。因此，臨床上針對肝癌的多學科綜合治療受到越來越多的重視[5-6]。評估肝癌切除術后患者的預后并為其制訂科學合理的綜合治療方案對于改善術后生存至關重要，而目前這一過程的實現仍面臨著一些挑戰。

二酯酰甘油激酶(DGK)是使二脂酰甘油(DAG)磷酸化產生磷脂酸(PA)的一類激酶；通過對DAG和PA作為第二信使所參與的體內諸多生理信號通路的調節，DGK在許多腫瘤的發生發展中發揮著重要作用[8-10]。DGKγ是DGK家族的Ⅰ型成員之一，目前關于DGKγ在腫瘤中的作用研究比較有限。除了Kai等[11]報道的DGKγ在結直腸癌中發揮抑癌作用外，作者的前期研究[12]發現DGKγ在肝癌的發生發展中扮演著腫瘤抑制因子的角色。此外，該研究還發現相比于肝癌組織中DGKγ的低表達，癌旁組織中DGKγ的表達水平較高；且相比于肝癌組織中DGKγ高表達組的32.87個月的中位生存期，癌/癌旁組織中DGKγ非低表達組的中位生存期則為50.43個月[12]。這些結果提示了癌旁組織中DGKγ的表達水平可能對肝癌患者的預后也存在影響，但目前尚無對此的直接研究報道。本文通過相關的比較和生存分析，首次探究了肝癌患者癌旁組織中DGKγ的表達水平與肝癌術后預后的直接關系，并評估了其作為預后指標的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2008年12月—2012年8月于鄭州大學附屬腫瘤醫院被診斷為肝癌并行手術切除術的患者82例；經長期隨訪最終入組的患者為78例，隨訪率為95.1%。78例患者均為伴有肝硬化的肝癌患者，其中男67例，女11例，平均(54.32±10.74)歲。納入的患者符合：肝腫瘤手術切除，術后病理證實為HCC；一般情況較好，肝功能Child分級為A級或B級；術前未進行放化療。排除臨床資料不完整、合并有血液及免疫系統疾病及失訪的患者。長期隨訪采用醫院就診和電話相結合的方式，第1年每3個月隨訪1次，隨后每6個月隨訪1次，最后隨訪日期為2018年7月1日。

1.2 臨床資料的采集 收集研究對象的年齡、性別等臨床基本信息；術前實驗室檢查：HBsAg、AFP、ALT、AST、ALP、GGT、TBil、Alb、球蛋白(Glb)、RBC、PLT、PT、國際標準化比值(INR)、纖維蛋白原(FIB)；以及術中輸血、腫瘤大小和數目、癌栓、切緣等資料。

1.3 癌旁組織中DGKγ的檢測 取手術切除腫瘤后距離腫瘤邊緣1～2 cm范圍的肝組織50 mg作為癌旁組織樣本，-80 ℃凍存保存，在研缽中加入適量的液氮充分研磨，之后收集至10 ml離心管中，加入1 ml TRIzol吹打混勻，室溫靜置5 min。然后提取RNA，經逆轉錄后，以C末端結合蛋白1為內參基因，通過實時熒光定量PCR(SYBR Green I Master Mix, Roche)檢測癌旁組織中DGKγ mRNA的表達水平。

1.4 倫理學審查 本研究方案經由北京大學生物醫學倫理委員會審批，批號：IRB00001052-12088，患者均知情同意。

2 結果

2.1 癌旁組織DGKγ 低表達組與高表達組的臨床資料比較 78例HCC患者癌旁DGKγ表達水平分別為0.079 5(0.007 0～1.697 5)。通過受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析78例HCC患者的癌旁DGKγ檢測值對患者長期生存狀態的預測能力，曲線下面積(AUC)為0.733(P=0.001)，確定癌旁DGKγ的最佳截斷界值為0.086 2(圖1)。以0.086 2為界，將78例患者分為低表達組(DGKγ<0.086 2，簡稱LEP組,n=41)和高表達組(DGKγ≥0.086 2，簡稱HEP組,n=37)。

圖1 癌旁DGKγ預測患者生存狀態的ROC曲線

78例患者的臨床資料如表1所示，18例HBsAg陰性的患者中抗-HBc和抗-HCV陽性的患者分別為4例和3例。比較肝癌患者癌旁組織DGKγ LEP組與HEP組的臨床資料，結果顯示：LEP組中的PT低于HEP組，差異具有統計學意義(P<0.05)；而2組間的年齡、性別、HBsAg(陽性/陰性)、術中輸血、BCLC分期、腫瘤大小和數目及其他的實驗室指標的差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表1)。

2.2 肝癌生存預后的單因素及多因素Cox回歸分析 單因素Cox分析結果顯示HBsAg、AFP、Alb、PLT、術中輸血、BCLC分期、腫瘤大小、腫瘤數目、切緣及癌旁組織DGKγ對肝癌患者術后OS的影響差異具有統計學意義(P值均<0.05)(表2)。共線性診斷分析未發現單因素Cox分析有意義的指標存在共線性；將這些指標納入多因素Cox回歸模型，結果顯示癌旁DGKγ(HR=1.913，95%CI： 1.111～3.296，P=0.019)、HBsAg(HR=2.645，95%CI：1.264～5.537，P=0.010)、Alb(HR=0.952，95%CI：0.916～0.990，P=0.013)、BCLC分期(HR=1.702，95%CI：1.267～2.286，P<0.001)、腫瘤大小(HR=1.083，95%CI：1.019～1.152，P=0.011)是肝癌患者術后OS的獨立影響因素；其中癌旁組織DGKγ的高表達是危險因素，HEP組的死亡風險是LEP組的1.913倍。

2.3 癌旁組織DGKγ LEP組與HEP組的生存曲線比較 基于以上結果，進一步分析比較LEP組與HEP組的生存情況。在78例總患者中，LEP組和HEP組OS近期差異(Breslow檢驗)與遠期差異(log-rank檢驗)均具有統計學意義(P值均<0.05，圖2a)，中位生存時間分別為45.0和22.9個月；LEP組與HEP組1、3、5年生存率分別為82.9%、56.1%、43.9%和64.9%、24.3%、13.5%。圖2b顯示出BCLC A期患者的OS要顯著優于BCLC B期和C期的患者，中位生存時間分別為43.9、22.9和11.5個月。隨后，分別分析比較了在BCLC A期、BCLC B和C期中LEP組與HEP組的生存差異。結果顯示，對于BCLC A期的患者，LEP組和HEP組OS的遠期差異具有統計學意義(P<0.05，圖2c)，中位生存時間分別為81.9和34.2個月；B期和C期患者中，LEP組和HEP組OS近期與遠期差異均無統計學意義(P值均>0.05，圖2d)，但前者中位生存時間要高于后者，分別為16.5和10.8個月。

注：a、c、d分別為所有患者、BCLC A期、BCLC B和C期中的LEP組與HEP組生存曲線；b為BCLC各期患者的生存曲線。

3 討論

近年來，全世界及中國的肝癌發病和死亡人數仍然呈現上升趨勢[5,7]。盡管隨著臨床圍手術期管理和診療技術的不斷進步，對合并有肝硬化的肝癌患者的外科手術干預的短期風險大大降低，但整個肝癌患者人群的長期預后仍不理想[1,5]。對術后患者進行長期生存風險的評估和預測，并為其制訂科學合理的隨訪復查與及時干預方案以達到改善肝癌患者術后長期生存的目的，是臨床醫生和研究人員長期努力的方向。既往作者實驗室及其他實驗室的研究結果表明HBsAg[13]、Alb[14-15]、腫瘤大小[16]和BCLC分期[15,17]是肝癌患者長期生存的獨立影響因素。而本研究中的結果也顯示這些指標對肝癌患者術后的長期生存有著一定的預測作用，同時這些風險因素也反映出肝癌患者的長期生存風險是受到了病毒性肝炎、肝功能及腫瘤本身的綜合影響作用。

DAG是脂質代謝過程中的中間產物，作為一種中性脂質也是細胞膜的重要構成成分；DAG經DGK磷酸化后可產生PA[18]。在體內許多的生物學進程中，DAG和PA作為關鍵的第二信使執行著特殊的功能任務，而DGK磷酸化DAG也是信使DAG的主要代謝方式[18]。不同亞型的DGK可以通過終止DAG信號和激活PA介導的通路來調控多種細胞內過程。近年來，關于DGK在腫瘤的增殖、侵襲和轉移等生物學進程中的作用受到越來越多的重視。研究較多的是DGKα，目前已知其在乳腺癌[19]、子宮內膜癌[20]、神經膠質母細胞瘤[21]和血液系統腫瘤[22]等惡性腫瘤中主要扮演著促癌基因的功能。這可能與腫瘤微環境能夠促進DGKα的表達有關；一方面，DGKα介導生成的PA能夠促進腫瘤的生存、遷移和耐藥性的產生；另一方面，DGKα所介導的DAG磷酸化代謝能夠減弱T淋巴細胞的應答反應并可使T淋巴細胞進入無應答狀態[10]。而在胃癌和結直腸癌中，DGKα的表達則是下調的，可能主要發揮了抑癌基因的功能[23-24]。對于肝癌，Takeishi等[25]研究發現表達上調的DGKα依賴于其激酶活性，可通過激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路促進肝癌細胞的增殖和腫瘤進展。

不同于DGKα，作者的前期研究發現DGKγ可通過其激酶活性下調肝癌細胞葡萄糖轉運體1的水平而發揮抑癌作用；而相比于肝癌組織中低表達DGKγ的患者，高表達組有著更長的中位生存時間(21.17個月vs 32.87個月,P=0.009 2)[12]。然而，本研究的結果發現癌旁組織中的DGKγ表達水平也是肝癌患者術后長期生存的獨立影響因素，癌旁組織中DGKγ的水平越低，患者的術后總體生存越好；在BCLC不同分期的亞組分析中也得到了相似的結果。不同于DGKγ在癌組織中發揮抑癌因子的作用，癌旁組織中DGKγ的表達水平對肝癌患者術后生存影響的具體機制可能與DGKγ參與DAG和PA代謝進而長期影響肝臟的代謝功能有關。一方面，癌旁組織DGKγ LEP組中肝功能Child-Pugh B級患者占7.3%，要低于HEP組的16.2%；另一方面前者的PT要顯著地低于后者；這些差異提示了癌旁組織中DGKγ可能通過調節肝臟的合成代謝功能來影響肝癌患者的預后。

綜上所述，對于肝癌患者，癌旁組織中DGKγ的表達水平是術后長期生存的獨立影響因素，可能是一種新的肝癌預后指標；其能夠在一定程度上幫助臨床醫師對術后患者的長期生存風險進行預測和評估，從而更好地幫助臨床決策。此外，本研究尚存在著樣本量少的局限性，擴大研究的樣本量及探索相關的具體作用機制是下一步的研究方向。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：錢相君、郭正陽負責課題設計，收集數據，資料分析和撰寫論文；王莉、聶涵笑參與收集數據；賀濤、王效謙、萬百順參與修改論文；姚明解、張玲負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。